Определение активности каталазы в растительном материале. Выявление органических веществ

Ферменты

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, образуемые любой живой клеткой и обладающие способностью активизировать различные химические соединения.

Механизм действия ферментов, как и всех других катализаторов, связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции, направляя ее обходным путем через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньшей энергии активации. Так, реакция АВ А + В в присутствии фермента идет следующим образом: АВ+Ф→АВФ; АВФ→А+ВФ; ВФ→В+Ф. →

Все ферменты разделяют на два большие класса: однокомпонентные и двухкомпонентные.

К первому классу относятся ферменты, состоящие только из белка, обладающего каталитическими свойствами, а ко второму классу - ферменты, которые состоят из белка и связанной с ним небелковой части, так называемой активной группой. Для названия активных групп двухкомпонентных ферментов часто используют термин кофермент, или простетическая группа. У однокомпонентных ферментов роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в белок. Эти группировки получили название активных или каталитических центров.

Одним из свойств ферментов, отличающихся от свойств неорганических катализаторов, является их большая лабильность - зависимость от ряда воздействий: концентрации водородных ионов, температуры, окислительно-восстановительных условий, концентрации некоторых соединений (продуктов обмена веществ), ионов металлов и т.п.

Вторая весьма существенная особенность каталитического действия ферментов состоит в том, что оно строго специфично, то есть действие ферментов направлено на совершенно определенные химические связи.

По характеру своего каталитического воздействия ферменты разделяются на шесть классов:

1) оксидоредуктазы или окислительно-восстановительные ферменты;

2) трансферазы, т.е. ферменты, катализирующие перенос различных групп атомов с одной молекулы на другую;

3) гидролазы, катализирующие гидролитические реакции;

4) лиазы - ферменты, которые отщепляют от субстратов ту или иную группу (не путем гидролиза) с образованием двойной связи или наоборот, присоединяют к двойным связям;

5) изомеразы, т.е. ферменты, катализирующие реакции изомеризации органических соединении;

6) лигазы или синтетазы - к этому классу принадлежат ферменты, которые катализируют синтетические реакции.

Каждый из этих классов подразделяется на подклассы, а эти последние, в свою очередь, на более мелкие группы.

На всех этапах переработки зерна в муку, в процессе его хранения, а также при приготовлении теста и выпечке хлеба, в большей или меньшей степени проявляется активность гидролитических и окислительных ферментов, оказывающих существенное влияние на качество продукта.

В зерне ферменты содержатся в тканях зародыша, алейронового слоя и эндосперма. Это характерные для живых растительных клеток ферменты, обуславливающие специфические функции в процессах обмена веществ.

Из множества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглись лишь те, которые оказывают или могут оказать воздействие на качество продуктов переработки зерна. К ним относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы, полифенолоксидазы и др. Наряду с этим было установлено, что некоторые ферменты зерна могут являться хорошими индикаторами его физиологического состояния. Так, каталаза, являясь очень термолабильной, хорошо отражает понижение всхожести при сушке семенного зерна, и ее активность может служить индикатором для контроля процесса сушки.

Исключительно велико биологическое значение амилаз при созревании и прорастании зерна, а также в ряде технологических процессов пищевых производств, имеющих в своей основе гидролитические превращения крахмала под влиянием амилаз зерна.

В зерне злаковых культур содержится два специфических фермента, обусловливающих гидролиз крахмала, а именно:

1) -1,4 - глюкангидролаза или αα-амилаза, гидролизующая α-1,4 - глюкановые связи крахмала и родственных ему полисахаридов, причем эти связи разрываются беспорядочно;

2) -1,4 – глюканмальтогидролаза или αβ – амилаза, гидролизующая α-1,4 – глюкановые связи в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей.

Несмотря на то, что протеазы имеют не менее важное значение для технологии, они изучены значительно меньше, чем амилазы. Причина этого заключается в том, что классические методы изучения протеаз животного происхождения (ферментов, гидролизующих белки) оказались малоэффективными при изучении протеолитических ферментов зерна злаков. Под влиянием протеаз происходят разжижение клейковины, что, в свою очередь, приводит к ухудшению качества выпекаемого хлеба.

Липазы вызывают гидролиз жиров, т.е. расщепляют сложные эфиры глицерина с образованием свободных жирных кислот, в результате чего повышается кислотность зерна и муки.

При участии липоксигеназ происходит окисление непредельных жирных кислот, образуются низкомолекулярные карбонильные и карбоксильные соединения, обладающие неприятным запахом и горьковатым вкусом. Этот процесс называют прогорканием жиров (муки).

Лабораторная работа №1.

Тема: Культивирование микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.

Цель работы: Выращивание продуцентов различных ферментов на твердых сыпучих средах и проведение анализа полученных культур на активность содержащихся в них ферментов.

Метод поверхностных культур . Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислород непосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы (анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих – для производства ферментных препаратов.

1.Подготовка посуды и ее стерилизация;

2.Приготовление питательной среды и ее стерилизация;

3.Расчет количества воды, необходимой для увлажнения питательной среды;

4.Увлажнение стерильной питательной среды, ее засев и раскладка в кюветы для выращивания;

1.Подготовка посуды к стерилизации. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена в сушильном шкафу.

Для стерилизации следует завернуть в бумагу, и аккуратно завязать веревочками следующие предметы: кювету, крышку к кювете.

Стерилизацию посуды и воды следует проводить в автоклаве при температуре 120ºС в течение 0,5 ч.

Стерильная посуда после автокловирования должна быть подсушена в сушильном шкафу при 105 ºС, так как бумага при стерилизации слегка увлажняется.

2. Приготовление и стерилизация питательной среды. Для каждого микроорганизма готовится своя питательная среда, обеспечивающих биосинтез определенных ферментов.Среда для каждой кюветы стерилизуется отдельно. Приготовленная среда помещается либо в пакет, либо многослойную салфетку из марли, либо в широкий стеклянный стакан. Для Asp. oryzae, например, используется следующие варианты питательных сред: пшеничных отрубей-100,70; солодовых ростков-30; свекловичного жома-50; выжимок винограда-20; солодовых ростков-50; рисовой шелухи-50.

3. Для нормального развития микроскопического гриба и интенсивного образования ферментов необходимо, чтобы среда имела влажность 58-63%.

Расчет количества добавляемой воды проводится по следующим данным:

Acp- масса питательной среды с исходной влажностью;

Сср- масса питательной среды с требуемой влажностью;

Гср- масса питательной среды после стерилизации;

Д- количество воды, которое необходимо добавить для получения питательной среды требуемой влажности.

Лабораторная работа №2

Тема: Экстрагирование ферментов, выращенных поверхностным способом

Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.

Метод экстрагирования поверхностных культур . Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислороднепосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы(анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих- для производства ферментных препаратов.

В данной лабораторной работе удобнее всего использовать микроскопические грибы или дрожжеподобные микроорганизмы, например такие, как Asp niger. Rh. Delemar и др.

Лабораторная работа №3

Тема: Культивирование микроорганизмов глубинным способом.

Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов глубинным способом.

Глубинное культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом процессе весь объем питательной среды засевают посевным материалом и выращивание ведут в оптималных условиях определенный промежуток времени, пока не накопится нужное количество биомассы или целевого продукта. Для обеспечения роста аэробных культур в глубоких слоях жидкости необходимо поступление кислорода. Так как микробные клетки способны использовать только растворенный кислород, а растворимость его невелика(4-7 мг/г)

Простым и доступным способом периодического глубинного культивирования является выращивание аэробных культур в суспендированном состоянии в жидкой среде, разлитой в небольших объемах в пробирки и колбы.

Непрерывное глубинное культивирование ведут в лабораторных ферментаторах. Процесс непрерывного выращивания в ферментаторе осуществляется по типу хемостата или турбидостата.

Целью настоящей работы является выращивание продуцентов различных ферментов на жидких питательных средах глубинным способом и анализ получаемых культур микроорганизмов на содержание в них определенных ферментов.

Как в первой лабораторной работе необходимо полуичть посевной материал, который готовят, выращивая продуцент в несколько пассажей на агаризованных средах в пробирках или матрацах.

В лабораторной работе студент готовит 0,7дм 3 питательной среды. Первоначально на технических весах взвешивается стакан, а затем в стакан отвешиваются все необходимые компоненты среды. Жидкие компоненты среды отмериваются по объему.

Соли растворяются без особых предосторожностей. Крахмал или мука смешиваются в соотношении 1:10 с холодной водой и завариваются на кипящей водяной бане.

Варианты питательных сред для культивирования микроорганизмов- продуцентов ферментов.

Таблица 1

Для каждого варианта берут по четыре колбы, в каждую наливают по 120 см 3 приготовленной среды. Колбы закрывают ватными пробками, пробки прикрывают бумажными плотными колпаками, чтобы онине увлажнялись при стерилизации. Одновременно с качалочными колбами на стерилизацию ставят колбу с 50 см 3 среды для последующего определения ее рН.

Определения рН среды

рН среды определяют электрометрическим методом дважды: до и после стерилизации, осуществляется каждый раз по три повторности этих определений и анализируя затем достоверность этих результатов.

Засев питательной среды

После того как стерилизация окончена и автоклав открыт, пипетки помещают на 10-15 мин. В горячий сушильный шкаф для подсушивания бумаги, колбы и остальные посуды оставляют в автоклаве на 10-15 мин. Засев питательной среды проводят в боксе.

Лабораторная работа №4

Определение активности каталазы

Каталаза относится к первому классу ферментов (оксидоредуктаз) и катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и кислород по уравнению:

Каталаза играет важную роль в жизнедеятельности организмов, так как она разрушает ядовитую для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO→ 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств 0,1 моль/дм 3 раствора КМnО 4 , израсходованных на титрование в контрольном и рабочем опытах.

Испытуемый материал: солод (проросшее зерно)

Реактивы: раствор перекиси водорода ω (H 2 O 2) = 1 %

раствор серной кислоты ω (H 2 SO 4) = 10 %

раствор перманганата калия С (1/5 KMnO 4) = 0,1 моль/дм 3

5 г испытуемого материала настаивают при комнатной температуре в течение 30 минут со 100 см 3 воды, периодически перемешивая содержимое колбы. После настаивания жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр и из прозрачного раствора отбирают пипеткой две порции по 20 см 3 (одна опытная и одна контрольная) и переносят каждую в отдельную коническую колбу на 200 см 3 . Контрольную кипятят 3 мин для инактивации фермента.

К опытной и контрольной пробам прибавляют по 20 см 3 дистил-лированной воды, по 4 см 3 перекиси водорода, и оставляют на 20 мин при комнатной температуре для действия фермента. По истечении 20 мин к пробам прибавляют по 5 см 3 серной кислоты, и оставшуюся (не разложившуюся) перекись водорода титруют раствором перманганата калия.

Активность каталазы выражают в микромолях перекиси водорода, разложившейся под действием фермента за 1 мин в расчете на 1 г исследуемого материала.

Активность каталазы определяют по формуле:

где Х – активность каталазы;

а - количество 0,1 моль/дм 3 раствора KMnO 4 , израсходованного на титрование контрольного раствора, см 3 ;

b - количество 0,1 моль/дм 3 раствора KMnO 4 , израсходованного на титрование опытного раствора, см 3 ;

К – поправка к титру;

100 – общий объем экстракта, см 3 ;

50 – коэффициент пересчета на микромоли H 2 O 2 ;

20 – объем ферментного раствора, см 3 ;

20 – время ферментативной реакции, мин;

Р - навеска испытуемого материала, взятого для анализа, г.

Лабораторная работа №5.

Колориметрический метод определения активности α- и β-амилазы

Под действием амилаз в растениях происходит гидролиз высоко-полимерного углевода - крахмала - с образованием декстринов и мальтозы. В растениях встречаются α- и β-амилазы.

Раздельное количественное определение активности α- и β-амилаз основано на их различной термостабильности: β-амилаза разрушается нагреванием до 70 °С, α -амилаза при этом сохраняет свою активность.

Методы определения активности амилазы основаны либо на учете количества сахара, образовавшегося при действии фермента на крахмал, либо на учете количества нерасщепленного ферментом крахмала, которое определяют фотометрически после обработки раствором иода.

Реактивы: ацетатный буфер с рН 5,5;

раствор хлорида натрия ω (NаСl) =1 %;

раствор крахмала ω = 10 % , (2 г крахмала, размешанного в 20 см 3 холодной воды, выливают в 80 см 3 кипящей воды, после чего нагревают на кипящей водяной бане до просветления раствора);

раствор соляной кислоты С(HCl) =1 моль/дм 3

раствор соляной кислоты С(HCl) =0,1 моль/дм 3

раствор йода ω = 0,3 % в 3 %-ном растворе йодистого калия.

Навеску 0,5 - 1 г муки или проростков растирают в ступке с небольшим количеством 1 %-ного раствора NаСl и переносят в коническую колбу на 50 см 3 . Соотношение между навеской и раствором NаСl 1:10 или 1:20. Содержимое колбы хорошо перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем фильтруют через плотный складчатый фильтр. При трудном фильтровании можно сочетать фильтрование и центрифугирование при 4000-5000 об/мин. Прозрачный раствор используют как ферментный препарат.

Для определения активности α- и β-амилазы берут 4 пробирки (2 опытные и 2 контрольные) и вносят в них по 3 см 3 ацетатного буфера и 3 см 3 2%-ного раствора крахмала. Смесь нагревают на водяной бане или в термостате до 40°С. Затем в опытные пробирки вносят по 0,2-1,0 см 3 ферментного препарата (в зависимости от активности амилаз в объекте изучения), а в контрольные - такое же количество Н 2 О. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 40 °С на 30 или 60 мин. После инкубации в каждую пробирку сразу приливают по 2 см 3 1 н. раствора НСl для прекращения действия амилаз.

Для выявления непрореагировавшего с ферментом крахмала проводят реакцию с йодом. В мерные колбы на 50 см 3 приливают около 30 см 3 воды, 1 см 3 0,1 н. НСl, 5 капель 0,3 %-го раствора иода и вносят из каждой пробирки по 0,5 см 3 смеси. Содержимое колб хорошо перемешивают, доводят до метки водой и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре или на спектрофотометре при 595 нм в кювете с рабочей длиной 1 см.

Для определения активности α-амилазы в коническую колбу на 100 см 3 приливают 5 см 3 фильтрата (ферментного препарата), добавляют на кончике ножа сухого уксуснокислого кальция и выдерживают в течение 15 мин в ультратермостате или на водяной бане при 70°С (допускаются колебания температуры не более 0,5°С). Затем содержимое колбы быстро охлаждают в сосуде с холодной водой. При таком прогревании β -амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Далее определение α -амилазной активности сводится к описанной выше процедуре.

Действие обоих ферментов выражают в миллиграммах гидролизованного крахмала в условиях опыта (за 30 мин или 1 ч) на 1 г муки (проростков). Активность β-амилазы определяют по разности между суммарной активностью α- и β-амилаз и активностью α-амилазы. Активность амилаз на 1 г муки за 1 ч рассчитывают по следующей формуле:

где D - оптическая плотность контрольного раствора;

D 1 - оптическая плотность опытного раствора;

а - количество внесенного крахмала (60 мг);

m - масса навески, г;

V - объем исходной ферментной вытяжки, см 3

V 1 - объем вытяжки, взятой для инкубирования, см 3 .

Лабораторная работа № 6

©2015-2019 сайт
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-02-13

(По А.Н. Баху и А.И. Опарину)

Все разнообразные превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются специфическими белками.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и при сравнительно низкой температура тела. Биологическое значение этого явления очень велико.

Для изучения действия ферментов необходимо выделить их из живых тканей. Обычно для этой цели подбирают легко доступный источник, богатый данным ферментом. Для того, чтобы перевести фермент в раствор, необходимо разрушить клеточные оболочки, что достигается с помощью гомогенизатора, растирания в ступке с пестиком, замораживания и оттаивания, автолиза и др. Обычно, разрушение клеточных оболочек производят при низкой температуре, благодаря чему приостанавливаются все ферментативные процессы в тканях.

К группе окислительно-восстановительных ферментов относится гемсодержащий ферменткаталаза , которая катализирует реакцию разложения перекиси водорода с освобождением молекулярного кислорода:

2 Н 2 О 2 --> 2 Н 2 О + О 2

Каталаза находится в большинстве тканей живого организма.

Принцип метода.

Перекись водорода разлагается каталазой. Избыток перекиси водорода титруют перманганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 --> 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

В опыте определяют количество оставшейся неразрушенной перекиси водорода, в контроле - общее количество взятой перекиси водорода (каталаза в контрольной пробе инактивирована кипячением).

Вычитая результаты опыта из результатов контроля, узнают количество разрушенной в определенный промежуток времени перекиси водорода, что позволяет судить об активности каталазы.

Оборудование: 1. Бюретки прямые на 50 и 100 мл (по 1 шт.)

2. Цилиндр на 10 мл

3. Ступка с пестиком

4. Конические колбы на 200-250 мл (2 шт.)

5. Технические весы с разновесами

6. Пипетка на 10 мл "вытяжка фермента"

7. Пипетка "H 2 SO 4 "

8. Кипящая водяная баня

9. Шпатель

10. Колба мерная на 100 мл

11. Воронка

12. Фильтровальная бумага

Материалы: 1. Свежий растительный материал (морковь или картофель)

2. 0.1н раствор Н 2 О 2

3. 0.1н раствор KMnO4

4. 10%-ный раствор H 2 SO 4

5. СаСО 3 (крист.)

6. Песок кварцевый

Ход работы:

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют.

В коническую колбу на 200 мл берут из бюретки 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0.1н раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшейся перекиси водорода.

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл) К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют 0.1н раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование всего количества пе­рекиси водорода.

По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной пе­рекиси водорода. Согласно уравнению реакции между KMnO 4 и H 2 O 2 , 1 мл 0.1н раствора перманганата калия соответствует 1.7 мг перекиси водорода.

Пример расчета.

Из 1.25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл. На титрование опытной пробы затрачено 15.5 мл,контрольной-30.2 мл 0.1н раствора перманганата калия. Количество разложенной перекиси водорода в пробе эквивалентно 30.2-15.5=14.7 мл 0.1н раствора перманганата калия и, следовательно, равно 14.7*1.7=24.99 мг.

В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 30 мин разложить (24.99*100)/(20*1.25)=99.96 мг перекиси водорода, а за 1 мин - 99.96/30=3.33 мг. Так как

1 мкмоль перекиси водорода составляет 0.034 мг, то в 1 г моркови присутствует 33.3/0.034=100 Е каталазы.

Лабораторная работа №4

Получение сахаразы из дрожжевых клеток. Специфичность действия ферментов.

Все разнообразные химические превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются с п е ц и ф и ч е с к и м и б е л к а м и.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и сравнительно при низкой температуре тела.

Изучение свойств ферментов, условий их действия, определение содержания ферментов в различных органах и тканях имеет большое значение для правильного понимания сложнейших процессов жизнедеятельности организма.

Одним из важнейших свойств ферментов является специфичность их действия в отношении определенного субстрата. Специфичность каталитических свойств ферментов проявляется в том, что фермент, как правило, действует лишь на определенное вещество. На строгую специфичность ферментов указывает и тот факт, что в случаях стереоизомерии определенный фермент катализирует расщепление только одного стереоизомера. Специфичность ферментов - их важнейшее биологическое свойство, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ.

В данной работе рассматриваются процессы расщепления ферментом сахаразой субстрата - сахарозы и расщепления крахмала ферментом - амилазой, которая содержится в слюне человека.

Экстракция сахаразы из дрожжевых клеток

Материалы и реактивы:

· Прессованные дрожжи– 10 г

· Гомогенизатор (ступка с пестиком)

· Кварцевый песок

· Вода дистиллированная

Ход работы

10 грамм сухих дрожжей поместить в ступку, добавить 10 мл дистиллированной воды и гомогенизировать в фарфоровой ступке с небольшим количеством кварцевого песка для разрушения клеточных стенок. Затем фарфоровую ступку с гомогенизатом поместить в сушильный шкаф с температурой 60 0 Сна 30-40 минут.

По истечении указанного времени вынуть ступку, охладить, добавить 30 мл дистиллированной воды и растереть содержимое ступки до однородной массы.

Затем гомогенизат, для осаждения клеточной массы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная надосадочная жидкость – экстракт сахаразы.

Приложение №1.

И н с т р у к ц и я по проведению лабораторной работы.

Лабораторная работа №3

Тема:

Цель: сформировать знания о роли ферментов в клетках; выяснить ферментативные свойства белков-пероксидаз; закрепить умение работать с микроскопом; проводить опыты и объяснять результаты работы.

Оборудование: свежий 3%-ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, ткани растений (кусочки сырого и варёного картофеля) и животных (кусочки сырого и варёного мяса), песок, ступка и пестик.

Дополнительные сведения: пероксид водорода образуется в клетке в процессе обмена веществ, обладает мутагенным действием. Н2О2 - вещество химически нестойкое и способно самопроизвольно разлагаться с образованием устойчивых соединений: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2

Х о д р а б о т ы.

1. Приготовьте четыре пробирки со свежим 3%-ный раствором пероксида водорода, затем поместите в первую пробирку кусочек сырого картофеля, во вторую – кусочек варёного картофеля, в третью – кусочек сырого мяса, в четвёртую – кусочек варёного мяса. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой пробирке.

2. Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке.

3. Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка. Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните туда немного пероксида водорода. Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.

4. Объясните полученные результаты.

Ответьте на вопросы:

Как проявляется активность ферментов в живых и мёртвых тканях?

Различается ли активность ферментов в растительных и животных тканях?

Как влияет измельчение ткани на активность фермента?

Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода?

Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент пероксидазу,

обеспечивающий разложение пероксида водорода?

Образец отчёта по лабораторной работе

«Каталитическая активность ферментов в живых тканях»

Вывод: действие ферментов-пероксидаз сходно в растительных и животных клетках, общность физиологических процессов – одно из доказательств родственных связей между растительными и животными организмами.

Тема: Каталитическая активность ферментов в живых клетках

Цель: выявить каталитическую функцию белков в живых клетках, сформировать знания о роли ферментов в клетках, закрепить умение работать с микроскопом, проводить опыты и объяснять результаты работы. Оборудование: сырой и варёный картофель, лист элодеи (другого растения), свежий 3% -ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, песок, ступка и пестик, тетрадь, ручка, простой карандаш, линейка.

Ход работы:

Приготовьте двепробирок, и поместите в первую немного песка, во вторую - кусочек сырого картофеля, в третью – кусочек варёного картофеля Капните в каждую из пробирок немного пероксида водорода. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой из пробирок.

Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка.

Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните немного пероксида водорода.

Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.

Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке. Объясните полученные результаты. Ответьте на вопросы:

Наблюдения

Перекись водорода и сырой картофель

Выделяется кислород, белок распадается до первичной структуры и превращается в пену

Перекись водорода и вареный картофель

Реакции нет

Ответьте на вопросы: В каких пробирках проявилась активность фермента каталазы? Объясните, почему.

Каталаза фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О. Биологическая роль К. заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода. Генетически обусловленная недостаточность К. является одной из причин так называемой акаталазии - наследственного заболевания, клинически проявляющегося изъязвлением слизистой оболочки носа и ротовой полости, иногда резко выраженными атрофическими изменениями альвеолярных перегородок и выпадением зубов. Активность проявилась в 1,3 пробирках, т.к. в них были сырые продукты, содержащие белки. А в остальных пробирках были продукты с разрушенным в процессе варки белком и реакция не проявилась. Поэтому организмом лучше усваиваются продукты, содержащие белок.

Как проявляется активность фермента в живых и мёртвых тканях? Объясните наблюдаемое явление. В мертвых тканях активность ферментов отсутствует, т.к. белок в них был разрушен при варке. А в живых тканях при взаимодействии с перекисью водорода выделялся кислород, а белок расщепляясь до первичной структуры превращался в пену.

Как влияет измельчение ткани на активность фермента в живых тканях растений и животных? При измельчении живой ткани реакция проходит быстрее, т.к. площадь соприкосновения белка и перекиси водорода увеличивается Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода? v=kc(a)c(b) где v является скоростью химической реакции k – константа скорости с – изменение концентрации Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент каталазу, обеспечивающий разложение пероксида водорода?

Ответ обоснуйте. Так как это фермент класса оксидоредуктаз, то он катализирует разложение токсичного для живых клеток пероксида водорода на воду и кислород. Содержится в лизосомах. Можно сделать вывод, что содержится во всех клетках живых организмов. Объясните свои наблюдения. Сформулируйте вывод.

Вывод: белок содержится только в живых продуктах, а в варенных продуктах белок разрушен, поэтому никакой реакции с ними не происходит. Если же измельчить продукты, то реакция будет проходить быстрее.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой)

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н 2 О 2 ) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2Н 2 О 2 → О 2 + 2Н 2 О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы : 1) 1% раствор Н 2 О 2 ; 2) 10% раствор серной кислоты ; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление : в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета : моль-эквивалент Н 2 О 2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н 2 О 2 ; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н 2 О 2 , которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы : каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

Показатель каталазы составляет 2-3х10 -:6 , в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н 2 О 2 (2 Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 ) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н 2 О 2 ; 2) 4 % раствор молибдата аммония.

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37 ° С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Е оп и Е хол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,210 3 – коэффициент экстинкции, ммоль –1 см –1 .

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6 + 0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.