Молекулярная биология растений. Молекулярная биология как наука лекция к.б.н. тазабаевой к.а

Для кого? Старшеклассники, студенты.
Что дает? Знание основ молекулярной биологии.
Преподаватели. Заведующий лабораториями молекулярной генетики микроорганизмов Института биологии гена РАН, профессор Университета Ратгерса (США), профессор Сколковского института науки и технологий (SkolTech).
Когда? Необходимо уточнять.
Стоимость. 9 000 р.
Условия участия. Необходимо оставить заявку на участие на сайте.

Биологические кружки. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Для кого? 9–11 классы.
Что дает? Знания по биологии, навык выполнения проектных работ, навык работы в лаборатории.
Преподаватели. Сотрудники биологического факультета МГУ.
Когда?
Стоимость. Необходимо уточнять.
Условия участия. Необходимо уточнять.

Биологическое отделение Московской гимназии № 1543 на Юго-Западе.

Для кого? 7–10 классы.
Что дает? Углубленные знания биологии.
Преподаватели. Сотрудники МГУ, выпускники гимназии.
Когда? Есть возможность отслеживать даты начала набора.
Обязательные требования. Необходимо пройти вступительные испытания.
Стоимость. Бесплатно (существует добровольный взнос).
Условия участия. Поступление в гимназию на полноценное обучение.

Школа «Хим*Био*Плюс». Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова.

Для кого? 10–11 классы.
Что дает? Знания по биологии, химии.
Когда? Набор - ежегодно, в сентябре.
Обязательные требования . Набор по результатам тестирования.
Стоимость. 10 000 - 75 000 р. (есть пробное занятие).

Академия. «ПостНаука».

Для кого? Школьники, студенты.
Что дает?

• знания в области физики элементарных частиц, химии, медицины, математики, нейрофизиологии, генетики, социологии, компьютерных наук;
• знание о том, как научные разработки применяются в реальной жизни.

Преподаватели. Высококвалифицированные специалисты, ученые.
Когда? Есть возможность отслеживать даты набора Вконтакте и Facebook .
Стоимость. 9 000 р.
Условия участия. Необходимо отслеживать нужный курс . Зарегистрироваться на курс, оплатить обучение.

Петрозаводск

STEM-центр Петрозаводского государственного университета.

Для кого? 1–11 классы.
Что дает? Навыки проектной, научно-исследовательской деятельности в области программирования, биологии, химии, физики.
Когда? Есть возможность отслеживать даты начала набора.
Стоимость. Необходимо уточнять.
Условия участия. Учащиеся петрозаводских школ.

Открытый университетский лицей Петрозаводского государственного университета.

Для кого? 10 класс.
Что дает?

• техническое направление (физика, математика, информатика, русский язык);
• медико-биологическое (химия, биология, русский язык).

Когда? Есть возможность отслеживать даты начала набора.
Стоимость. Необходимо уточнять.
Условия участия. Гражданство РФ, заявление, оплата обучения.

Мастер-классы

«Строение и функции клетки» - урок в музее.

Для кого? 14–16 лет.
Что дает?

• практические навыки по биологии;
• навык работы с микроскопом;
• навык проведения эксперимента.

Когда? Необходимо уточнять.
Стоимость. Необходимо уточнять.
Продолжительность. 90 минут.
Особые условия посещения. Последний вторник месяца - санитарный день.
Как записаться? Оставить заявку на сайте.

«Мир под микроскопом».

Для кого? 6–16 лет.
Что дает? Наблюдение микроорганизмов, строения клетки под микроскопом.
Когда? Необходимо уточнять.
Стоимость. 200 р.
Продолжительность. 1 час.
Особые условия посещения. Сборные занятия (для посетителей от 6 лет) проходят в выходные дни и дни школьных каникул по расписанию.
Как записаться? Оставить заявку на сайте.

Урок химии «Самое удивительное вещество на Земле».

Для кого? 14–16 лет.
Что дает?

• знания о свойствах воды;
• навык проведения лабораторных экспериментов.

Когда? Необходимо уточнять.
Стоимость. 16 000 р. за сдвоенную группу по 15 человек в каждой.
Продолжительность. 90 минут.

Лагеря

Московская область

Лагерь по химии «Слон и жираф».

Для кого? 9–11 классы.
Когда? Ежегодно.
Что дает?

• знания по химии;
• навыки работы с реактивами.

Примечание: учебные программы меняются каждую смену, поэтому необходимо уточнять их содержание у организаторов.
Преподаватели. Высококвалифицированные практикующие медики разных специализаций, профессиональные биологи, ученые.
Стоимость. 32 000 р.
Условия участия. Необходимо подать заявку на сайте.

Образовательный центр «Сириус». Направление «Наука». Смены «Химия», «Биология».

Для кого? 10–17 лет.
Что дает? Углубленное знание профильных предметов, расширение кругозора и личностное развитие.
Преподаватели. Ученые, педагоги ведущих вузов, физико-математических и химико-биологических школ, тренеры национальных и региональных сборных по математике, физике, химии и биологии.
Когда? Ежегодно. Есть возможность отслеживать даты набора.
Обязательные требования. Глубокие знания профильных предметов, уровень всероссийских, международных олимпиад.
Стоимость. Бесплатно.
Условия участия. Подать заявку на сайте. Возможен конкурсный отбор. Подробности необходимо уточнять у организаторов или отслеживать на сайте.

Вузы

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Биологический факультет.
Год создания: 1930.
Что дает?
Квалификация:

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова.

Кафедра биохимии и молекулярной биологии.
Год создания: 1963.
Что дает? Готовит квалифицированных специалистов.
Квалификация: специалист, срок обучения - 6 лет.

Новосибирск

Новосибирский государственный университет.

Факультет естественных наук. Биологическое отделение. Кафедра молекулярной биологии.
Год создания: 1959.
Что дает? Готовит квалифицированных специалистов.
Квалификация: бакалавр, срок обучения - 4 года, магистр - 2 года.

Онлайн-курсы

На русском языке

«Реальная математика». Электронная школа «Знаника».

Для кого? 5–9 классы.
Что дает? Углубленное знание математики.
Когда? В любое время.
Преподаватели. Кандидаты физико-математических, педагогических наук, доценты, профессора и преподаватели ведущих вузов страны.
Условия участия. Необходима регистрация.

Виртуальная химическая лаборатория. Марийский государственный технический университет.

Для кого? 8–11 классы.
Что дает? Навык работы в химической лаборатории, навык выполнения опытов в режиме реального времени.
Стоимость. 3 500 - 9 000 р.
Условия участия. Оформить заказ.

Mark Zentrum. Международный образовательный онлайн-центр.

Для кого? С 11 лет.
Что дает? Программы обучения по биологии, химии, математике, иностранным языкам.
Когда? Индивидуальные занятия согласовываются с преподавателем. Групповые занятия проходят в соответствии с расписанием.
Преподаватели. Лингвисты, практикующие преподаватели профильных предметов.
Стоимость. Пробный урок - бесплатно. Индивидуальные занятия: один урок - 450–1200 р., в зависимости от количества занятий (минимум пять) и от продолжительности урока. Групповые занятия: один урок - 280–640 р.
Стоимость занятий по иностранному языку. Пробный урок с носителем языка - платный: 10 евро. Стоимость одного занятия: 15–35 евро, в зависимости от продолжительности урока.
Продолжительность. Зависит от формы занятий. Индивидуальное занятие - 45–90 минут, занятие в группе - 90 минут, вебинар - 120 минут. Первое пробное занятие - 30–40 минут.
Условия участия. Заполнить заявку-анкету на пробный урок.
Особые условия. Необходимые материалы и учебники высылаются преподавателем в электронном виде (есть возможность приобрести учебные материалы в печатном виде).

На английском языке

Лекция. Surprises and Discovery in Catalysis.

Для кого? Школьники, студенты.
Что дает? Знания о последних достижениях в области катализа.
Преподаватели. Erick M. Carreira, профессор органической химии в университете Цюриха.
Когда? В любое время.
Стоимость. Бесплатно.

Виртулаб по химии на английском языке. Есть возможность настроить русский язык.

Для кого? Школьники.
Что дает? Навык работы в лаборатории с сотнями реагентов в режиме реального времени.
Когда? В любое время.
Стоимость. Бесплатно.

Детективно-химический виртулаб. Расследование преступления с помощью знания химии.

Для кого? Школьники, студенты.
Что дает? Навык применения знаний по химии в игровой форме.
Когда? В любое время.
Продолжительность квеста. 40–50 минут.
Стоимость. Бесплатно.
Условия участия. Загрузить программу на компьютер.

Молекулярная биология пережила период бурного развития собственных методов исследования, которыми теперь отличается от биохимии. К ним, в частности, относятся методы генной инженерии , клонирования , искусственной экспрессии и нокаута генов . Поскольку ДНК является материальным носителем генетической информации, молекулярная биология значительно сблизилась с генетикой , и на стыке образовалась молекулярная генетика , являющаяся одновременно разделом генетики и молекулярной биологии. Так же, как молекулярная биология широко применяет вирусы как инструмент исследования, в вирусологии для решения своих задач используют методы молекулярной биологии. Для анализа генетической информации привлекается вычислительная техника, в связи с чем появились новые направления молекулярной генетики, которые иногда считают особыми дисциплинами: биоинформатика , геномика и протеомика .

История развития

Это основополагающее открытие было подготовлено длительным этапом исследований генетики и биохимии вирусов и бактерий .

В 1928 году Фредерик Гриффит впервые показал, что экстракт убитых нагреванием болезнетворных бактерий может передавать признак патогенности неопасным бактериям. Исследование трансформации бактерий в дальнейшем привело к очистке болезнетворного агента, которым, вопреки ожиданиям, оказался не белок , а нуклеиновая кислота . Сама по себе нуклеиновая кислота не опасна, она лишь переносит гены, определяющие патогенность и другие свойства микроорганизма.

В 50-х годах XX века было показано, что у бактерий существует примитивный половой процесс, они способны обмениваться внехромосомной ДНК, плазмидами . Открытие плазмид, как и трансформации , легло в основу распространённой в молекулярной биологии плазмидной технологии . Ещё одним важным для методологии открытием стало обнаружение в начале XX века вирусов бактерий, бактериофагов . Фаги тоже могут переносить генетический материал из одной бактериальной клетки в другую. Заражение бактерий фагами приводит к изменению состава бактериальной РНК . Если без фагов состав РНК сходен с составом ДНК бактерии, то после заражения РНК становится больше похожа на ДНК бактериофага. Тем самым было установлено, что структура РНК определяется структурой ДНК. В свою очередь, скорость синтеза белка в клетках зависит от количества РНК-белковых комплексов. Так была сформулирована центральная догма молекулярной биологии : ДНК ↔ РНК → белок.

Дальнейшее развитие молекулярной биологии сопровождалось как развитием её методологии, в частности, изобретением метода определения нуклеотидной последовательности ДНК (У. Гилберт и Ф. Сенгер , Нобелевская премия по химии 1980 года), так и новыми открытиями в области исследований строения и функционирования генов (см. История генетики). К началу XXI века были получены данные о первичной структуре всей ДНК человека и целого ряда других организмов, наиболее важных для медицины, сельского хозяйства и научных исследований, что привело к возникновению нескольких новых направлений в биологии: геномики, биоинформатики и др.

См. также

• Молекулярная биология (журнал)
• Транскриптомика
• Молекулярная палеонтология
• EMBO - Европейская организация молекулярных биологов

Литература

• Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998.
• Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981.
• Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.
• Патрушев Л. И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. - 000 с., ил. ISBN 5-02-001890-2

Ссылки

• Материалы по молекулярной биологии от Российской Академии Наук

Wikimedia Foundation . 2010 .

• Ардатовский район Нижегородской области
• Арзамасский район Нижегородской области

Смотреть что такое "Молекулярная биология" в других словарях:

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - изучает осн. свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Важнейшими направлениями в М. б. являются исследования структурно функциональной организации генетического аппарата клеток и механизма реализации наследственной информации… … Биологический энциклопедический словарь

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и др. явления обусловлены … Большой Энциклопедический словарь

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Современная энциклопедия

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, биологическое изучение строения и функционирования МОЛЕКУЛ, из которых состоят живые организмы. К основным сферам изучения относятся физические и химические свойства белков и НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, таких как ДНК. см. также… … Научно-технический энциклопедический словарь

молекулярная биология - раздел биол., который исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и… … Словарь микробиологии

молекулярная биология - — Тематики биотехнологии EN molecular biology … Справочник технического переводчика

Молекулярная биология - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и… … Иллюстрированный энциклопедический словарь

Молекулярная биология - наука, ставящая своей задачей познание природы явлений жизнедеятельности путём изучения биологических объектов и систем на уровне, приближающемся к молекулярному, а в ряде случаев и достигающем этого предела. Конечной целью при этом… … Большая советская энциклопедия

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ - изучает явления жизни на уровне макромолекул (гл. обр. белков и нуклеиновых к т) в бесклеточных структурах (рибосомы и др.), в вирусах, а также в клетках. Цель М. б. установление роли и механизма функционирования этих макромолекул на основе… … Химическая энциклопедия

молекулярная биология - исследует основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Выясняет, каким образом и в какой мере рост и развитие организмов, хранение и передача наследственной информации, превращение энергии в живых клетках и другие явления… … Энциклопедический словарь

Можно сказать, что молекулярная биология исследует проявления жизни на неживых структурах или системах с элементарными признаками жизнедеятельности (которыми могут быть отдельные биологические макромолекулы, их комплексы или органеллы), изучая, каким образом ключевые процессы, характеризующие живую материю, реализуются посредством химических взаимодействий и превращений.

Выделение молекулярной биологии из биохимии в самостоятельную область науки продиктовано тем, что её главной задачей является изучение структуры и свойств биологических макромолекул, участвующих в различных процессах, выяснение механизмов их взаимодействия. Биохимия же занимается изучением собственно процессов жизнедеятельности, закономерностей их протекания в живом организме и превращений молекул, сопровождающих эти процессы. В конечном счёте, молекулярная биология пытается ответить на вопрос, зачем происходит тот или иной процесс, тогда как биохимия отвечает на вопросы где и как с точки зрения химии происходит рассматриваемый процесс.

История

Молекулярная биология как отдельное направление биохимии начала формироваться в 30-х годах прошлого столетия. Именно тогда для углублённого понимания феномена жизни возникла необходимость в целенаправленных исследованиях на молекулярном уровне процессов хранения и передачи наследственной информации в живых организмах. Тогда и определилась задача молекулярной биологии в изучении структуры, свойств и взаимодействия нуклеиновых кислот и белков. Термин «молекулярная биология» был впервые употреблен английским учёным Уильямом Астбери в контексте исследований, касавшихся выяснения зависимостей между молекулярной структурой и физическими и биологическими свойствами фибриллярных белков, таких, как коллаген, фибрин крови или сократительные белки мышц.

На заре возникновения молекулярной биологии РНК считалась компонентом растений и грибов, а ДНК рассматривалась как типичный компонент животных клеток. Первым исследователем, доказавшим, что ДНК содержится в растениях, был Андрей Николаевич Белозерский , выделивший в 1935 году ДНК гороха. Это открытие установило тот факт, что ДНК является универсальныой нуклеиновой кислотой, присутствующей в клетках растений и животных.

Серьёзным достижением стало установление Джорджем Бидлом и Эдуардом Татумом прямой причинно-следственной связи между генами и белками. В своих экспериментах они подвергали клетки нейроспоры (Neurospora crassa ) ретгеновскому облучению, вызывавшему мутации. Полученные результаты показали, что это приводило к изменению свойств специфических ферментов.

В 1940 году Альбер Клод выделил из цитоплазмы животных клеток цитоплазматические РНК-содержащие гранулы, которые были меньше митохондрий. Он назвал их микросомами. Впоследствии при исследовании структруы и свойств выделенных частиц была установлена их основополагающая роль в процессе биосинтеза белка. В 1958 году на первом симпозиуме, посвящённом этим частицам, было принято решение называть эти частицы рибосомами.

Ещё одним важным шагом в развитии молекулярной биологии стали опубликованные в 1944 г. данные эксперимента Освальда Эвери, Колина МакЛауда и Маклина МакКарти, показавшие, что причиной трансформации бактерий является ДНК. Это было первое экспериментальное доказательство роли ДНК в передаче наследственной информации, развенчавшее бытовавшее ранее представление о белковой природе генов.

В начале 50-х годов Фредерик Сэнгер показал, что белковая цепь является уникальной последовательностью аминокислотных остатков. В конце 50-х годов Макс Перуц и Джон Кендрю расшифровали пространственное строение первых белков. Уже в 2000 году были известны сотни тысяч природных аминокислотных последовательностей и тысячи пространственных структур белков.

Примерно в то же время исследования Эрвина Чаргаффа позволили ему сформулировать правила, описывающие соотношение азотистых оснований в ДНК (правила гласят, что независимо от видовых различий в ДНК количество гуанина равно количеству цитозина, а количество аденина равно количеству темина), что помогло в дальнейшем сделать величайший прорыв в молекулярной биологии и одно из величайших открытий в биологии вообще.

Это событие произошло в 1953 году, когда Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик , основываясь на работах Розалинды Франклин и Мориса Уилкинса по рентгено-структурному анализу ДНК, установили двухспиральную структуру молекулы ДНК. Это открытие позволило ответить на принципиальный вопрос о способности носителя наследственной информации к самовоспроизведению и понять механизм передачи такой информации. Этими же учеными был сформулирован принцип комплементарности азотистых оснований, имеющий ключевое значение для понимания механизма образования надмолекулярных структур. Это принцип, применяемый теперь для описания всех молекулярных комплексов, позволяет описывать и предсказывать условия возникновения слабых (невалентных) межмолекулярных взаимодействий, обуславливающих возможность формирования вторичной, третичной и т.д. структуры макромолекул, протекания самосборки надмолекулярных биологических систем, определяющих столь большое разнообразие молекулярных структур и их функциональных наборов. Тогда же, в 1953 году возник научный журнал Journal of Molecular Biology. Его возглавил Джон Кендрю, сферой научных интересов которого было исследование структуры глобулярных белков (Нобелевская премия 1962 года совместно с Максом Перуцем). Аналогичный русскоязычный журнал под названием «Молекулярная биология» был основан в СССР В. А. Энгельгардтом в 1966 году.

В 1958 году Фрэнсис Крик сформулировал т.н. центральнаю догму молекулярной биологии: представление о необратимости потока генетической информации от ДНК через РНК к белкам по схеме ДНК→ДНК (репликация, создание копии ДНК), ДНК→РНК (транскрипция , копирование генов), РНК→ белок (трансляция, декодирование информации о структуре белков). Эта догма в 1970 году была несколько поправлена с учётом накопленных знаний, поскольку было открыто явление обратной транскрипции независимо Ховардом Темином и Дэвидом Балтимором: был обнаружен фермент - ревертаза, отвечающий за осуществление обратной транскрипции - образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК, которое происходит у онкогенных вирусов. Следует отметить, что строгая необходимость потока генетической информации от нуклеиновых кислот к белкам до сих пор остаётся основой молекулярной биологии.

В 1957 году Александр Сергеевич Спирин совместно с Андреем Николаевичем Белозерским показали, что, при существенных различиях в нуклеотидном составе ДНК из разных организмов, состав суммарных РНК сходен. На основании этих данных они пришли к сенсационному заключению о том, что суммарная РНК клетки не может выступать в качестве переносчика генетической информации от ДНК к белкам, поскольку не соответствует ей по своему составу. Вместе с тем они заметили, что существует минорная фракция РНК, которая полностью соответствует по своему нуклеотидному составу ДНК и которая может быть истинным переносчиком генетической инфрмации от ДНК к белкам. В результате они предсказали существование относительно небольших молекул РНК, являющихся по строению аналогами отдельных участков ДНК и выполняющих роль посредников при передаче генетической информации, содержащейся в ДНК, в рибосому, где с использованием этой информации осуществляется синтез белковых молекул. В 1961 году (С. Бреннер , Ф. Жакоб , М. Месельсон с одной стороны и Ф. Гро, Франсуа Жакоб и Жак Моно первыми получили опытное подтверждение существования таких молекул - информационной (матричной) РНК. Тогда же они разработали концепцию и модель функциональной единицы ДНК - оперона, которая позволила объяснить, как именно осуществляется регуляция экспрессии генов у прокариот. Исследование механизмов биосинтеза белка и принципов структурной организации и работы молекулярных машин - рибосом - позволило сформулировать постулат, описывающий движение генетической информации, называемый центральной догмой молекулярной биологии: ДНК - иРНК - белок.

В 1961 году и в течение последующих нескольких лет Хайнрихом Маттэем и Маршаллом Ниренбергом, а затем Харом Кораной и Робертом Холли были проведены несколько работ по расшифровке генетического кода, в результате которых была установлена непосредственная взаимосвязь между структурой ДНК и синтезируемыми белками и определена последовательность нуклеотидов, определяющая набор аминокислот в белке. Также были получены данные об универсальности генетического кода. Открытия были отмечены нобелевской премией 1968 года.

Для развития современных представлений о функциях РНК решающим было открытие некодирующих РНК, сделанное по результатам работ Александра Сергеевича Спирина совместно с Андреем Николаевичем Белозерским 1958 года, Чарльзом Бреннером с соавторами и Солом Шпигельманом 1961 года. Этот вид РНК составляют основную часть клеточных РНК. К некодирующим в первую очередь относятся рибосомные РНК.

Серьёзное развитие получили способы культивирования и гибридизации животных клеток. В 1963 году Франсуа Жакобом и Сиднеема Бреннером были сформулированы представления о репликоне - последовательности неотъемлемо реплицирующихся генов, объясняющей важные аспекты регуляции репликации генов.

В 1967 году в лаборатории А. С. Спирина было впервые продемонстрировано, что форма компактно свёрнутой РНК определяет морфологию рибосомной частицы.

В 1968 году было сделано значительное фундаментальное открытие. Оказаки, обнаружив фрагменты ДНК отстающей цепи при исследовании процесса репликации, названные в честь неё фрагментами Оказаки, уточнила механизм репликации ДНК.

В 1970 году независимо Ховардом Темином и Дэвидом Балтимором было сделано значительное открытие: был обнаружен фермент - ревертаза, отвечающий за осуществление обратной транскрипции - образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК, которое происходит у онкогенных вирусов, содержащих РНК.

Ещё одним важным достижением молекулярной биологии стало объяснение механизма мутаций на молекулярном уровне. В результате серии исследований были установлены основные типы мутаций: дупликации, инверсии, делеции, транслокации и транспозиции. Это дало возможность рассматривать эволюционные изменения с точки зрения генных процессов, позволило разработать теорию молекулярных часов, которая применяется в филогении.

К началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме. Было установлено, что белки и нуклеиновые кислоты в организме синтезируются по матричному механизму, молекула-матрица несёт в себе зашифрованную информацию о последовательности аминокислот (в белке) или нуклеотидов (в нуклеиновой кислоте). При репликации (удвоении ДНК) или транскрипции (синтезе иРНК) такой матрицей служит ДНК, при трансляции (синтезе белка) или обратной транскрипции - иРНК.

Таким образом, были созданы теоретические предпосылки для развития прикладных направлений молекулярной биологии, в частности, генетической инженерии . В 1972 году Пол Берг , Герберт Боер и Стэнли Коэн разработали технологию молекулярного клонирования. Тогда ими впервые была получена в пробирке рекомбинантная ДНК. Эти выдающиеся эксперименты заложили основы генетической инженерии, а этот год считается датой рождения этого научного направления.

В 1977 году Фредерик Сэнгер, и независимо Аллан Максам и Уолтер Гилберт разработали различные методы определения первичной структуры (секвенирования) ДНК. Метод Сэнгера, так называемый метод обрыва цепи, является основой современного метода секвенирования. Принцип секвенирования основан на использовании меченых оснований, выступающих в качестве терминаторов в циклической реакции секвенирования. Этот метод получил широкое распространение благодаря возможности быстро проводить анализ.

1976 г. - Фредерик. Сэнгер расшифровал нуклеотидную последовательность ДНК фага φΧ174 длиной 5375 нуклеотидных пар.

1981 г. - серповидноклеточная анемия становится первой генетической болезнью, диагностируемой с помощью анализа ДНК.

1982-1983 открытие каталитической функции РНК в американских лабораториях Т. Чека и С. Олтмана изменило существовавшее представления об исключительной роли белков. По аналогии с каталитическими белками - энзимами, каталитические РНК были названы рибозимами.

1987 год Кери Мюллез открыл полимеразную цепную реакцию, благодаря которой возможно искусственно значительно увеличить количество молекул ДНК в растворе для дальнейшей работы. На сегодняшний день это один из наиболее важных методов молекулярной биологии, применяющийся при исследовании наследственных и вирусных заболеваний, при изучении генов и при генетическом установлении личности и установлении родства и т.п.

В 1990 году одновременно тремя группами учёных был опубликован метод, позволявший быстро получать в лаборатории синтетические функционально активные РНК (искусственные рибозимы или молекулы, взаимодействующие с различными лигандами - аптамеры). Этот метод получил название «эволюция в пробирке». А вскоре после этого, в 1991-1993 года в лаборатории А.Б. Четверина была экспериментально показана возможность существования, роста и амплификации молекул РНК в форме колоний на твёрдых средах.

В 1998 году практически одновременно Крейг Мелло и Эндрю Фаер описали наблюдавшийся ранее при генных экспериментах с бактериями и цветами механизм РНК-интерференции , при котором небольшая двухцепочечная молекула РНК приводит к специфичному подавлению экспрессии гена.

Открытие механизма РНК-интерференции имеет очень важное практическое значение для современной молекулярной биологии. Это явление широко используется в научных экспериментах в качестве инструмента для «выключения», то есть, подавления экспрессии отдельных генов. Особый интерес вызван тем, что этот способ позволяет осуществлять обратимое (временное) подавление активности изучаемых генов. Ведутся исследования возможности применения этого явления для лечения вирусных, опухолевых, дегенеративных и метаболических заболеваний. Следует отметить, что в 2002 году были открыты мутанты вирусы полиомиелита, способные избегать РНК-интерференции, поэтому требуется ещё кропотливая работа для разработки действительно эффективных методов лечения на основе этого явления.

В 1999-2001 годах несколькими группами исследователей определена с разрешением от 5,5 до 2,4 ангстрем структура бактериальной рибосомы.

Предмет

Достижения молекулярной биологии в познании живой природы трудно переоценить. Больших успехов удалось достичь благодаря удачной концепции исследований: сложные биологические процессы рассматриваются с позиции отдельных молекулярных систем, что позволяет применять точные физико-химические методы исследования. Это также привлекло в эту область науки много великих умов из смежных направлений: химии, физики, цитологии, вирусологии , что также благотворно повлияло на масштабы и скорость развития научных знаний в этой области. Столь значимые открытия, как определение структуры ДНК, расшифровка генетического кода, искусственная направленная модификация генома, позволили значительно глубже понять специфику процессов развития организмов и успешно решать многочисленные важнейшие фундаментальные и прикладные научные, медицинские и социальные задачи, которые ещё не так давно считались неразрешимыми.

Предметом изучения молекулярной биологии являются в основном белки, нуклеиновые кислоты и молекулярные комплексы (молекулярные машины) на их основе и процессы, в которых они участвуют.

Нуклеиновые кислоты представляют собой линейные полимеры, состоящие из нуклеотидных звеньев (соединений пятичленного сахара с фосфатной группой при пятом атоме цикла и одного из четырёх азотистых оснований), соединённых между собой сложноэфирной связью фосфатных групп. Таким образом, нуклеиновая кислота - это пентозофосфатный полимер с азотистыми основаниями в качестве боковых заместителей. Химический состав цепочки РНК отличается от ДНК тем, что первая состоит из пятичленного цикла углевода рибозы, тогда как вторая - из дегидрокслилированного производного рибозы - дезоксирибозы. При этом пространственно эти молекулы различаются кардинально, поскольку РНК - это гибкая одноцепочечная молекула, тогда как ДНК - это двуцепочечная молекула.

Белки - это линейные полимеры, представляющие собой цепочки альфа-аминокислот, соединённых между собой пептидной связью, откуда их второе название - полипептиды. В состав природных белков входит множество различных аминокислотных звеньев - у человека до 20 -, что определяет широкое разнообразие функциональных свойств этих молекул. Те или иные белки принимают участие почти в каждом процессе в организме и выполняют множество задач: играют роль клеточного строительного материала, обеспечивают транспорт веществ и ионов, катализируют химические реакции, - список этот очень длинный. Белки образуют устойчивые молекулярные конформации различного уровня организации (вторичные и третичные структуры) и молекулярные комплексы, что ещё больше расширяет их функционал. Эти молекулы могут обладать высокой специфичностью к выполнению каких-либо задач благодаря образованию сложной пространственной глобулярной структуры. Большое разнообразие белков обеспечивает постоянный интерес учёных к этому виду молекул.

Современные представления о предмете молекулярной биологии основаны на обобщении, выдвинутом впервые в 1958 году Фрэнсисом Криком как центральная догма молекулярной биологии. Суть её заключалась в утверждении, что генетическая информация в живых организмах проходит строго определённые этапы реализации: копирование из ДНК в ДНК входе наследования, из ДНК в РНК, а затем из РНК в белок, причём обратный переход не осуществим. Это утверждение было справедливо лишь от части, поэтому впоследствии центральная догма была поправлена с оглядкой на открывшиеся новые данные.

На данный момент известно несколько путей реализации генетического материала, представляющих различные последовательности осуществления трёх видов существования генетической информации: ДНК, РНК и белок. В девяти возможных путях реализации выделяют три группы: это три общих превращения (general), осуществляющиеся в норме в большинстве живых организмов; три особых превращения(special), осуществляющиеся в некоторых вирусах или в особых лабораторных условиях; три неизвестных превращения (unknown), осуществление которых, как считается, невозможно.

К общим превращениям относятся следующие пути реализации генетического кода: ДНК→ДНК (репликация), ДНК→РНК (транскрипция), РНК→белок (трансляция).

Для осуществления передачи наследственных признаков родителям необходимо передать потомкам полноценную молекулу ДНК. Процесс, благодаря которому на основе исходной ДНК может быть синтезирована её точная копия, а следовательно, может быть передан генетический материал, называется репликацией. Он осуществляется специальными белками, которые распутывают молекулу (выпрямляют её участок), расплетают двойную спираль и при помощи ДНК-полимеразы создают точную копию исходной молекулы ДНК.

Для обеспечения жизнедеятельности клетки ей необходимо постоянно обращаться к генетическому коду, заложенному в двойной спирали ДНК. Однако эта молекула слишком велика и неповоротлива для применения её в качестве непосредственного источника генетического материала для непрерывного синтеза белка. Поэтому в ходе реализации информации, заложенной в ДНК, есть посредническая стадия: синтез иРНК, представляющей собой небольшую одноцепочечную молекулу, комплементарную определённому отрезку ДНК, кодирующему некоторый белок. Процесс транскрипции обеспечивается РНК-полимеразой и факторами транскрипции. Полученная молекула затем может быть легко доставлена в отдел клетки, ответственный за синтез белка - рибосому.

После попадания и РНК в рибосому наступает заключительная стадия реализации генетической информации. При этом рибосома считывает с иРНК генетический код триплетами , называющимися кодонами и синтезирует на основе получаемой информации соответствующий белок.

В ходе особых превращений генетический код реализуется по схеме РНК→РНК (репликация), РНК→ДНК (обратная транскрипция), ДНК→белок (прямая трансляция). Репликация такого вида реализуется во многих вирусах, где она осуществляется ферментом РНК-зависимой РНК-полимеразой. Аналогичные ферменты находятся и в клетках эукариот, где они связаны с процессом РНК-глушения (silencing). Обратная транскрипция обнаружена в ретровирусах, где она осуществляется под действием фермента обратной транскриптазы, а также в некоторых случаях в эукариотических клетках, например, при теломерном синтезе. Прямая трансляция осуществляется только в искусственных условиях в изолированной системе вне клетки.

Любой из трех возможных переходов генетической информации из белка в белок, РНК или ДНК считается невозможным. Случай воздействия прионов на белки, в результате которого образуется аналогичный прион, условно можно было бы отнести к виду реализации генетической информации белок→белок. Тем не менее, формально он таковым не является, поскольку не затрагивает аминокислотную последовательность в белке.

Любопытна история возникновения термина «центральная догма». Поскольку слово догма в общем случае означает утверждение, которое не подлежит сомнению, а само слово имеет явный религиозный подтекст, выбор его в качестве описания научного факта не совсем правомерен. По признанию самого Фрэнсиса Крика, это была его ошибка. Он хотел придать выдвигаемой теории большей значимости, выделить её на фоне остальных теорий и гипотез; для чего решил использовать это величественное, по его представлению, слово, не понимая его истинного смысла. Название это, однако, прижилось.

Молекулярная биология сегодня

Бурное развитие молекулярной биологии, постоянный интерес к достижениям в этой области со стороны общества и объективная важность исследований привели к возникновению большого числа крупных научно-исследовательских центров молекулярной биологии по всему миру. Среди крупнейших следует упомянуть следующие: лаборатория молекулярной биологии в Кембридже, Королевский институт в Лондоне - в Великобритании; институты молекулярной биологии в Париже, Марселе и Страсбурге, Пастеровский институт - во Франции; отделы молекулярной биологии в Гарвардском университете и Массачусетском технологическом институте, университете в Беркли, в Калифорнийском технологическом институте, в Рокфеллеровском университете, в институте здравоохранения в Бетесде - в США; институты Макса Планка, университеты в Гёттингене и Мюнхене, Центральный институт молекулярной биологии в Берлине, институты в Йене и Халле - в Германии; Каролинский институт в Стокгольме в Швеции.

В России ведущими центрами в этой области являются Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Институт молекулярной генетики РАН, Институт биологии гена РАН, Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН и Институт белка РАН в Пущино.

Сегодня область интересов молекулярных биологов охватывает широкий спектр фундаментальных научных вопросов. По-прежнему ведущую роль занимает изучение структуры нуклеиновых кислот и биосинтеза белка, исследования строения и функций различных внутриклеточных структур, и клеточных поверхностей. Также важными направления исследований являются изучение механизмов рецепции и передачи сигналов, молекулярных механизмов транспорта соединений внутри клетки а также из клетки во внешнюю среду и обратно. Cреди основных направлений научного поиска в области прикладной молекулярной биологии одной из наиболее приоритетных является проблема возникновения и развития опухолей. Также очень важным направлением, изучением которого занимается раздел молекулярной биологии - молекулярная генетика, является изучение молекулярных основ возникновения наследственных заболеваний, и вирусных заболеваний, например, СПИДа, а также разработка способов их предупреждения и, возможно, лечения на генном уровне. Широкое применение нашли открытия и разработки молекулярных биологов в судебной медицине. Настоящая революция в области идентификации личности была сделана в 80-х годах учёными из России, США и Великобритании благодаря разработке и внедрению в повседневную практику метода «геномной дактилоскопии» - установления личности по ДНК. Исследования в этой области не прекращаются и по сей день, современные методы позволяют устанавливать личность с вероятностью ошибки одна миллиардная процента. Уже сейчас идёт активная разработка проекта генетического паспорта, что, как предполагается, позволит сильно снизить уровень преступности.

Методология

Сегодня молекулярная биология располагает обширным арсеналом методов, позволяющих решать самые передовые и самые сложные задачи, стоящие перед учёными.

Одним из самых распространённых методов в молекулярной биологии является гель-электрофорез , который решает задачи разделения смеси макромолекул по размеру или по заряду. Почти всегда после разделения макромолекул в геле применяется блоттинг , метод, позволяющий переносить макромолекулы из геля (сорбировать ) на поверхность мембраны для удобства дальнейшей работы с ними, в частности гибридизации . Гибридизация - формирование гибридной ДНК из двух цепей, имеющих различную природу, - метод, играющий важную роль в фундаментальных исследованиях. Он применяется для определения комплементарных отрезков в разных ДНК (ДНК разных видов), с его помощью происходит поиск новых генов, с его помощью была открыта РНК интерференция, а его принцип лёг в основу геномной дактилоскопии.

Большую роль в современной практике молекулярно-биологических исследований играет метод секвенирования - определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах и аминокислот в белках.

Современную молекулярную биологию невозможно представить без метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Благодаря этому методу осуществляется увеличение количества (амплификация) копий некоторой последовательности ДНК, чтобы позволяет получить из одной молекулы достаточное количество вещества для дальнейшей работы с ним. Аналогичный результат достигается технологией молекулярного клонирования, в которой требующаяся нуклеотидная последовательность внедряется в ДНК бактерии (живых систем), после чего размножение бактерий приводит к необходимому результату. Этот подход технически значительно сложнее, однако позволяет одновременно получать результат экспрессии исследуемой нуклеотидной последовательности.

Также в молекулярно-биологических исследованиях широко применяются методы ультрацентрифугирование (для разделения макромолекул (больших количеств), клеток, органелл), методы электронной и флуоресцентной микроскопии, спектрофотометрические методы, рентгеноструктурный анализ, авторадиография, и т.п.

Благодаря техническому прогрессу и научным изысканиям в области химии, физики, биологии и информатики современное оборудование позволяет выделять, изучать и изменять отдельные гены и процессы, в которые они вовлечены.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ позднелат. molecula, уменьшительное от лат. moles масса; биология) - медико-биологическая наука, изучающая явления жизни на уровне биологических макромолекул - белков и нуклеиновых кислот, таких простых систем, как бесклеточные структуры, вирусы и, как предел, - на уровне клетки. Большая часть таких объектов является неживой или наделенной элементарными проявлениями жизни. Положение М. б. в системе биол, наук определяется представлениями о структурных уровнях живой материи, т. е. эволюционно сложившихся формах жизни, начинающихся с пребиотических ступеней и кончающихся сложными системами: малые органические молекулы - макромолекулы - клетка и субклеточные структуры - организм и т. д., соответственно к-рым строятся и уровни познания. Исторически М. б. сформировалась в результате исследования биологических макромолекул, в силу чего М. б. рассматривается как раздел биохимии (см.). М. б. является вместе с тем пограничной наукой, возникшей на стыке биохимии, биофизики (см.), органической химии (см.), цитологии (см.) и генетики (см.). Идея М. б. заключается в раскрытии элементарных механизмов основных процессов жизнедеятельности - наследственности (см.), изменчивости (см.), движения и др.- через исследование биол, макромолекул. Молекулярно-биол. представления нашли благодатную почву особенно в генетике - возникла молекулярная генетика (см.), и именно здесь были достигнуты результаты, к-рые способствовали развитию М. б. и признанию ее принципов. Представления М. б. имеют эвристическую (познавательную) ценность, т. к. на всех уровнях развития живой материи существуют и действуют биол, макромолекулы - белки (см.) и нуклеиновые кислоты (см.). По этой причине границы М. б. трудно определимы: она оказывается всепроникающей наукой.

Само название «молекулярная биология» принадлежит англ. кристаллографу Астбери (W. Т. Astbury). Формальной датой возникновения М. б. считают 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик установили структуру ДНК и высказали подтвердившееся позже предположение о механизме ее репликации, лежащей в основе наследственности. Но по крайней мере с 1944 г., начиная с работ Эйвери (О. Th. Avery), накапливались факты, указывавшие на генетическую роль ДНК; Н. К. Кольцов высказал идею о матричном синтезе в весьма ясной форме еще в 1928 г.; изучение молекулярных основ мышечного сокращения началось с работ В. А. Энгельгардта и М. Н. Любимовой, опубликованных в 1939-1942 гг. М. б. развивалась также в сфере эволюционного учения и систематики. В СССР инициатором изучения нуклеиновых к-т и исследований по молекулярным основам эволюции был А. Н. Белозерский.

Отличительная черта М. б. состоит в характере наблюдений, в ее методических приемах и построении эксперимента. М. б. заставила биологов по-новому взглянуть на материальную основу жизнедеятельности. Для молекулярно-биол. исследований характерно сопоставление биол, функций с хим. и физ. характеристиками (свойствами) биополимеров и в особенности с их пространственным строением.

Для понимания закономерностей строения нуклеиновых к-т и их поведения в клетке важнейшее значение имеет принцип комплементарности оснований в двухтяжевых структурах нуклеиновых к-т, установленный в 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком, Признание значения пространственных отношений нашло свое выражение в представлении о комплементарности поверхностей макромолекул и молекулярных комплексов, составляющей необходимое условие проявления слабых сил, действующих лишь на коротких дистанциях и способствующих созданию морфол, разнообразия биол. структур, их функциональной подвижности. Эти слабые силы участвуют в образовании комплексов типа фермент - субстрат, антиген - антитело, гормон - рецептор и т. п., в явлениях самосборки биол, структур, напр, рибосом, в образовании пар азотистых оснований в молекулах нуклеиновых к-т и в тому подобных процессах.

М. б. направила внимание биологов на простые, стоящие у границ жизни объекты, ввела в арсенал биол, исследований идеи и точные методы химии и физики. Мутационный процесс получил истолкование на молекулярном уровне как выпадение, вставка и перемещение отрезков ДНК, замена пары азотистых оснований в функционально значимых отрезках генома (см. Мутация). Явления мутагенеза (см.) были, т. о., переведены на хим. язык. Благодаря методам М. б. были раскрыты молекулярные основы таких генетических процессов у прокариотов, как рекомбинация (см.), трансдукции (см.), трансформация (см.), трансфекция, сексдукция. Достигнуты значительные успехи в изучении строения хроматина и хромосом эукариотов; усовершенствование методов культивирования и гибридизации животных клеток создало возможность развития генетики соматических клеток (см.). Регуляция репликации ДНК нашла свое выражение в представлении о репликоне Ф. Жакоба и Бреннера (S. Brenner).

В области биосинтеза белка был установлен так наз. центральный постулат, характеризующий следующее движение генетической информации: ДНК -> информационная РНК -> белок. Согласно этому постулату, белок является своего рода информационным клапаном, препятствующим возвращению информации на уровень РНК и ДНК. В процессе развития М. б. в 1970 г. Темином (H. Temin) и Балтимором (D. Baltimore) было открыто явление обратной транскрипции (в природе синтез ДНК происходит у онкогенных РНК-содержащих вирусов с помощью специального фермента - обратной транскриптазы). Синтезы белков и нуклеиновых к-т происходят по типу матричных синтезов, для их протекания необходима матрица (шаблон) - исходная полимерная молекула, к-рая предопределя-ет последовательность нуклеотидов (аминокислот) в синтезируемой копии. Такими матрицами при репликации и транскрипции является ДНК и при трансляции - информационная РНК. Генетический код (см.) формулирует способ «записи» наследственной информации в информационной РНК, другими словами, он согласует последовательность нуклеотидов в нуклеиновых к-тах и аминокислот в белках. С биосинтезом белка связана транскрипция - синтез информационных РНК на матрице ДНК, катализируемый РНК-полимеразами; трансляция - синтез белка на связанной с рибосомой информационной РНК, протекающий по весьма сложному механизму, в к-ром участвуют десятки вспомогательных белков и транспортные РНК (см. Рибосомы). Регуляция белкового синтеза наиболее изучена на уровне транскрипции и сформулирована в представлении Ф. Жакоба и Моно (J. Monod) об опероне, белках-репрессорах, аллостерическом эффекте, позитивной и негативной регуляции. Разнородным по своему содержанию и еще менее завершенным, чем предыдущие, разделом М. б. является целый ряд проблем фундаментального и прикладного характера. К ним относится репарация повреждений генома, причиненных коротковолновой радиацией, мутагенами (см.) и другими влияниями. Большую самостоятельную область составляют исследования механизма действия ферментов, основанные на представлениях о трехмерной структуре белков и роли слабых хим. взаимодействий. М. б. выяснила многие детали строения и развития вирусов, в особенности бактериофагов. Изучение гемоглобинов у лиц, страдающих серповидно-клеточной анемией (см.) и другими гемоглобинопатиями (см.), положило начало изучению структурной основы «молекулярных болезней», врожденных «ошибок» метаболизма (см. Наследственные болезни). Самая поздняя ветвь М. б.- генная инженерия (см.) - разрабатывает методы конструирования наследственных структур в виде молекул рекомбинантных ДНК.

В молекулярно-биол. опытах находят применение различные способы хроматографии (см.) и ультрацентрифугирования (см.), рентгеноструктурный анализ (см.), электронная микроскопия (см.), молекулярная спектроскопия (электронный парамагнитный и ядерный магнитный резонанс). Начато использование синхротронного (магнитно-тормозного) излучения, дифракции нейтронов, мессбауэровской спектроскопии, лазерной техники. В экспериментах широко применяются модельные системы, получение мутаций. Использование радиоактивных и (в меньшей мере) тяжелых изотопов составляет в М. б. обычный аналитический метод, так же как применение математических методов и ЭВМ. Если раньше молекулярные биологи ориентировались гл. обр. на физ. методы, созданные для исследования полимеров небиол. происхождения, то сейчас наблюдается все усиливающаяся тенденция к использованию хим. методов.

Для развития М. б. в СССР большое значение имело постановление ЦК КПСС и Совета Министров СССР «О мерах по ускорению развития молекулярной биологии и молекулярной генетики и использованию их достижений в народном хозяйстве», опубликованное 20 мая 1974 г. Исследования координируются Межведомственным научно-техническим советом по проблемам молекулярной биологии и молекулярной генетики при ГКНТ Совета Министров СССР и АН СССР, Научным советом по проблемам молекулярной биологии АН СССР, аналогичными советами АН союзных республик и отраслевых академий. Издается журнал «Молекулярная биология» (с 1967 г.) и реферативный журнал с тем же названием. Исследования по М. б. ведутся в ин-тах АН СССР, АМН СССР, республиканских академий наук, Главмикробиопрома, в высших учебных заведениях страны. В социалистических странах работают многие лаборатории такого профиля. В Европе действуют Европейская молекулярно-биологическая организация (ЕМБО), Европейская молекулярно-биологическая лаборатория (ЕМБЛ) в Гейдельберге, Европейская молекулярно-биологическая конференция (ЕМБК). Работают крупные специализированные лаборатории в США, Франции, Великобритании, ФРГ и других странах.

Специальные периодические издания, посвященные проблемам М. б., за рубежом: «Journal of Molecular Biology», «Nucleic Acids Research», «Molecular Biology Reports», «Gene».

Обзоры по М. б. публикуются в серии «Молекулярная биология» ВИНИТИ, в «Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology», «Progress in Biophysics and Molecular Biology», «Annual Rewiew of Biochemistry», изданиях «Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology».

Библиография: Ашмарин И. П. Молекулярная биология, Л., 1977; Белозерский А. Н. Молекулярная биология - новая ступень познания природы, М., 1970; Бреслер С. Е. Молекулярная биология, Л., 1973; Кольцов Н. К. Наследственные молекулы, Бюлл. Моск. об-ва испыт. природы, отд. биол., т. 70, в. 4, с. 75, 1965; Октябрь и наука, под ред. А.П. Александрова и др., с. 393, 417, М., 1977; Северин С. Е. Современные проблемы физико-химической биологии, в кн.: 250 лет Академии наук СССР, с. 332, М., 1977; Уотсон Дж. Молекулярная биология: гена, пер. с англ., М., 1978; Энгельгардт В. А. Молекулярная биология, в кн.: Развитие биол, в СССР, под ред. Б. Е. Быховского, с. 598, М., 1967.

Я кратко напомню так называемую центральную догму молекулярной биологии , в первоначальном виде сформулированную Фрэнсисом Криком . В общем случае она гласит, что генетическая информация при реализации передается от нуклеиновых кислот к белку, но не наоборот. А точнее, возможно передача ДНК → ДНК (репликация ), ДНК → РНК (транскрипция ) и РНК → белок (трансляция ). Так же существуют значительно реже реализуемые пути, свойственные некоторым вирусам: РНК → ДНК (обратная транскрипция ) и РНК → РНК (репликация РНК ). Также напомню, что белки состоят из аминокислотных остатков, последовательность которых закодирована в генетическом коде организма: три нуклеотида (их называют кодон , или триплет ) кодируют одну аминокислоту, причем одну и ту же аминокислоту может кодировать несколько кодонов.

Во второй половине XX века получили развитие технологии рекомбинантной ДНК (то есть, методы манипуляции ДНК, позволяющие различными способами изменять последовательность и состав нуклеотидов в молекуле). Именно на их основе происходит развитие всех молекулярно-биологических методов и поныне, хотя они стали значительно сложнее, как идейно, так и технологически. Именно молекулярная биология вызвала такой бурный рост количества биологической информации за последние полвека.

Я расскажу о методах манипуляции и изучения ДНК и РНК, совсем немного коснусь белков, поскольку в основном методы, связанные с ними, ближе к биохимии, чем к молекулярной биологии (хотя грань между ними в последнее время стала очень расплывчатой).

Разрезание и сшивание

Ферменты - белки, ускоряющие прохождение химических реакций. Они очень эффективны: ускорение может составлять несколько порядков! Например, фермент каталаза , расщепляющий перекись водорода, ускоряет реакцию примерно на 12 порядков, то есть в триллион раз! В то же время неорганический катализатор - мелкодисперсная платина - ускоряет эту же реакцию только на шесть порядков, или в миллион раз. Однако за это приходится платить очень строгими условиями работы большинства из них.

Рестрикционные эндонуклеазы

Рисунок 2. Сайты рестрикции. Сверху Sma I, при работе которой образуются «тупые» концы. Снизу - целевая последовательность рестриктазы Eco RI , при работе которой образуются «липкие» концы.

Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах . Этот метод был изобретен при изучении в 1950-1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами . Существует множество видов рестриктаз: к 2007-му году их было известно более 3000 . Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную - целевую - последовательность нуклеотидов ДНК (рис. 2). Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так, что рестриктаза не может с ними работать. (Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности - для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз.) Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует: чем длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину.

Новые эндонуклеазы продолжают открывать и по сей день. Многие из них до сих пор не клонированы, то есть, не известны гены, которые их кодируют, и в качестве «фермента» используют некую очищенную фракцию белков, обладающую нужной каталитической активностью. Новосибирская компания СибЭнзим долгое время успешно соревновалась с компанией New England Biolabs - признанным во всем мире лидером по поставке рестритаз (то есть предлагала такое же или большее различных рестриктаз, некоторые из которых весьма экзотичны). - Ред.

За выделение первой рестриктазы, изучение ее свойств и первое применение для картирования хромосом Вернер Арбер (Werner Arber ), Дэн Натанс (Dan Nathans ) и Гамильтон Смит (Hamilton Smith ) в 1978 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине .

ДНК-лигазы

Для создания новых молекул ДНК, разумеется, кроме разрезания, необходима еще и возможность сшивания двух цепей. Это делают с помощью ферментов, называемых ДНК-лигазами , которые сшивают сахаро-фосфатный остов двух цепей ДНК. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК.

Разделение молекул ДНК: электрофорез в геле

Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться.

Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза , . ДНК помещают в гель (обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением), который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду (аноду ), причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров (смесей фрагментов ДНК известных длин) можно установить длину молекул в образце (рис. 3).

Визуализовать результаты фореза можно двумя способами. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК (традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества). Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков (рис. 4). Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения (этот метод визуализации называют авторадиографией ).

Рисунок 4. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете (слева ). Вторая слева дорожка - маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле.

Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез , который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем (обычно полиакриламидным). Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид . Об одном из важных приложений такого метода читайте ниже в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру.

Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг

С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Гибридизация ДНК основана на образовании водородных связей между двумя цепями ДНК, приводящем к их соединению , .

Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд , комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10–1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть.

Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну , названную по имени ученого, ее изобретшего (Edwin Southern ). Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке (рис. 5).

Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом (northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern - «северный»). В этом случае проводят электрофорез в геле с молекулами мРНК, а в качестве зонда выбирают одноцепочечную молекулу ДНК или РНК.

Клонирование ДНК

Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части (а их сшивать с произвольными молекулами ДНК), разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома (например, определенный ген). В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину (по сравнению со всей ДНК клетки). Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет этой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве.

Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный - было рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Существует два основных метода: использование быстро делящихся организмов (обычно бактерий Escherichia coli - кишечной палочки - или дрожжей Saccharomyces serevisiae ) или проделать аналогичный процесс, но in vitro с помощью полимеразной цепной реакции .

Репликация в бактериях

Поскольку при каждом клеточном делении бактерии (как и любые другие клетки, не считая предшественников половых клеток) удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК . Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду (небольшую - относительно бактериальной хромосомы - кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы). У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся «горизонтально » между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам (именно из-за этого свойства их и открыли) или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. (Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций.) Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации (последовательность, с которой начинается репликация молекулы), целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой (обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику). В некоторых случаях (например, при изучении очень больших фрагментов ДНК) используют не плазмиду, а искусственную бактериальную хромосому .

В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию - процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды (рис. 6). После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости (а, следовательно, и плазмиду). Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК (или использую плазмиду целиком). Если же ген вставили в плазмиду для того, чтобы получить его белковый продукт, необходимо обеспечить культуре условия для роста, а потом просто выделить требуемый белок.

На этом месте сразу же должен возникать вопрос: как же все это возможно было использовать до того, когда были расшифрованы геномы, да и чтение последовательности ДНК было еще дорогим и малораспространенным? Положим, с помощью рестрикции и клонирования полученных фрагментов мы получим библиотеку ДНК , то есть набор бактерий, несущих различные плазмиды, содержащие суммарно весь геном (или заметную его часть). Но каким образом мы сможем понять, в каком из фрагментов содержится необходимый ген? Для этого использовали метод гибридизации. Сначала необходимо было выделить белок нужного гена. После чего отсеквенировать его фрагмент, обратить генетический код и получить последовательность нуклеотидов (конечно, из-за вырожденности генетического кода приходилось пробовать много различных вариантов). В соответствии с ней химически синтезировали короткую молекулу ДНК, которую и использовали в качестве зонда для гибридизации.

Но в некоторых случаях этот метод давал сбои - например, так произошло с фактором свертывания крови VIII. Этот белок участвует в свертывании крови , и нарушения в его функциональности являются причиной одного из самых распространенных генетических заболеваний - гемофилии А. Раньше для лечения приходилось выделять этот белок из большого числа организмов, потому что не удавалось клонировать его для производства бактериями. Связано это было с тем, что его длина составляет около 180000 пар нуклеотидов, и он содержит много интронов (некодирующих фрагментов между кодирующими) - неудивительно, что ни в одну плазмиду этот ген не попал целиком.

О механизмах свертывания крови см. «Как работает свертывание крови? ». - Ред.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка ДНК, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от репликации ДНК в клетках живых организмов, с помощью ПЦР амплифицируют сравнительно короткие участки ДНК (обычно, не более 3000 пар нуклеотидов, однако есть методы позволяющие «поднимать» до 20 тысяч пар нуклеотидов - так называемый Long Range PCR).

Фактически, ПЦР является искусственной многократной репликацией фрагмента ДНК (рис. 7). ДНК-полимеразы так устроены, что не могут синтезировать новую ДНК, просто имея в наличии матрицу и мономеры. Для этого необходима еще и затравка (праймер) , с которого они начинают синтез. Праймер - это короткий одноцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный ДНК-матрице. При репликации в клетке такие праймеры синтезируются специальным ферментом праймазой и являются молекулами РНК, которые позже заменяются на ДНК. Однако в ПЦР используют искусственно синтезированные молекулы ДНК, поскольку в этом случае не нужна стадия удаления РНК и синтеза на их месте ДНК. В ПЦР праймеры ограничивают амплифицируемый участок с обеих сторон.

Рисунок 7. Репликация ДНК - важнейший для живых организмов процесс, основа множества молекулярно-биологических методов. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи (их информационное содержание одинаково), при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых является точной (без учета ошибок синтеза) копией первоначальной молекулы.

Итак, пора объяснить, как же ПЦР работает. Изначально в реакционной смеси находятся: ДНК-матрица, праймеры, ДНК-полимераза, свободные нуклеозиды (будущие «буквы» в новосинтезированной ДНК), а также некоторые другие вещества, улучшающие работу полимеразы (их добавляют в специальные буферы, используемые в реакции).

Чтобы синтезировать ДНК, комплементарную матрице, необходимо, чтобы один из праймеров образовал с ней водородные связи (как говорят, «отжегся» на ней). Но ведь матрица уже образует их со второй цепью! Значит, сначала необходимо расплавить ДНК, - то есть разрушить водородные связи. Делают это с помощью простого нагревания (до ≈95 °С) - стадия, называемая денатурацией . Но теперь и праймеры из-за высокой температуры не могут отжечься на матрице! Тогда температуру понижают (50–65 °С), праймеры отжигаются, после чего температуру немного поднимают (до оптимума работы полимеразы, обычно, около 72 °С). И тогда полимераза начинает синтезировать комплементарные матрице цепи ДНК - это называют элонгацией (рис. 8). После одного такого цикла количество копий необходимых фрагментов удвоилось. Однако ничто не мешает повторить это еще раз. И не один, а несколько десятков раз! И с каждым повтором количество копий нашего фрагмента ДНК будет удваиваться, ведь новосинтезированные молекулы тоже будут служить матрицами (рис. 9)! (На самом деле эффективность ПЦР редко настолько высока, что количество копий именно удваивается , но в идеале это так, да и реальные числа часто бывают близки к этому.)

Рисунок 9. С каждым циклом ПЦР количество целевой ДНК удваивается.

Увидеть результаты ПЦР очень просто: достаточно провести электрофорез реакционной смеси после ПЦР, и будет видна яркая полоса с полученными копиями.

Раньше полимеразу, инактивирующуюся при нагревании с каждым циклом, приходилось все время добавлять, но вскоре было предложено использовать термостабильную полимеразу из термофильных бактерий, которая выдерживает такой нагрев, что сильно упростило проведение ПЦР (чаще всего используют Taq-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus ).

Чтобы избежать сильного испарения воды из реакционной смеси, в нее добавляют масло, покрывающее ее сверху, и/или используют нагревающуюся крышку термоциклера - прибора, в котором проводят ПЦР. Он быстро меняет температуру пробирок, и их не приходится постоянно перекладывать из одного термостата в другой. Для предотвращения неспецифического синтеза еще до нагрева и собственно начала циклов, часто использую ПЦР с «горячим стартом»: вся ДНК и полимераза разделяются между собой парафиновой прослойкой, которая плавится при высокой температуре и дает им взаимодействовать уже в правильных условиях. Иногда же используют модифицированные полимеразы, которые не работают при низкой температуре.

Можно еще много говорить о различных тонкостях ПЦР, но важнее всего сказать об альтернативных классическому форезу методах определения результатов. Например, довольно очевидным вариантом является добавление в реакционную пробирку перед началом реакции веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК. Тогда, сравнив изначальную флуоресценцию с конечной, можно увидеть, синтезировалось ли значительное количество ДНК или нет. Но этот способ не специфичен: мы никак не сможем определить, синтезировался ли необходимый фрагмент, или это какие-то праймеры слиплись и достроились до непредсказуемых последовательностей.

Наиболее интересным вариантом является ПЦР «в реальном времени» («real-time PCR») . Существует несколько реализаций этого метода, но идея везде одна и та же: можно прямо в ходе реакции наблюдать за накоплением продуктов ПЦР (по флуоресценции). Соответственно, для проведения ПЦР «в реальном времени» нужен специальный прибор, способный возбуждать и считывать флуоресценцию в каждой пробирке. Самое простое решение - добавить в пробирку те же самые вещества, которые флуоресцируют в присутствии ДНК, однако минусы такого метода уже были описаны выше.

Строго это называется «ПЦР с регистрацией флуоресценции в режиме реального времени» или «количественная ПЦР». - Ред.

Рисунок 11. Пример кривых накопления флуоресценции в ПЦР «в реальном времени»: зависимость интенсивности флуоресценции (в нескольких пробирках - на каждую своя кривая) от номера цикла.

Самой популярной реализацией такого подхода является метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда (TaqMan Assay; рис. 10). В этом случае в реакционной смеси должен присутствовать еще один компонент - специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор (флуоресцирующая молекула), а к другому - гаситель (молекула, поглощающая энергию флуорофора и «гасящая» флуоресценцию). Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´-экзонуклеазной активности, которой обладает Taq-полимераза (то есть она расщепляет ДНК, на которую «натыкается» в ходе синтеза, и на ее месте синтезирует новую), зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция.

Поскольку число копий в ходе ПЦР растет экспоненциально, так же растет и флуоресценция. Однако это продолжается недолго, поскольку в какой-то момент эффективность реакции начинает падать из-за постепенной инактивации полимеразы, нехватки каких-то компонентов и т. п. (рис. 11). Анализируя графики роста флуоресценции, можно много понять о протекании ПЦР, но, самое важное, можно узнать, сколько ДНК-матриц было изначально: это так называемая количественная ПЦР (quantitative PCR, qPCR).

Все варианты применения ПЦР в науке невозможно перечислить. Выделение фрагмента ДНК, секвенирование, мутагенез... ПЦР - один из самых востребованных для ненаучных целей метод (видео 1). Он широко применяется в медицине для ранней диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, определения отцовства, в расследованиях для установления личности и для многого другого.

Естественные клеточные процессы in vitro

Все основные молекулярно-биологические процессы могут быть легко проведены in vitro (то есть, в пробирке). Пример приведен выше: ПЦР - это аналог репликации ДНК. Для этого достаточно просто смешать необходимые реагенты в подходящих условиях: для транскрипции нужны ДНК-матрица, РНК-полимераза и рибонуклеотиды, для трансляции - мРНК, субъединицы рибосом и аминокислоты, для обратной транскрипции - РНК-матрица, обратная транскриптаза (она же ревертаза) и дезоксирибонуклеотиды. Эти методы широко применяются в различных областях биологии, когда необходимо, например, получить чистую РНК определенного гена. В этом случае нужно сначала провести обратную транскрипцию его (гена) мРНК, с помощью ПЦР амплифицировать ее, а затем с помощью in vitro- транскрипции получить много мРНК. Первая стадия необходима из-за того, что перед образованием зрелой мРНК в клетке проходит сплайсинг и процессинг РНК (у эукариот; у бактерий в этом смысле все проще) - подготовка к работе матрицей для синтеза белка. Иногда этого удается избежать, если вся кодирующая последовательность гена расположена в одном экзоне.

Секвенирование ДНК

Можно сказать, важнейшие методы манипуляции с ДНК уже описаны. Следующий этап - определение собственно нуклеотидной последовательности цепи в молекуле - секвенирование . Определение нуклеотидной последовательности ДНК крайне важно для множества фундаментальных и прикладных задач. Особое место оно занимает в науке: для анализа результатов секвенирования геномов была, фактически, создана новая наука - биоинформатика . Секвенированием сейчас пользуются молекулярные биологи, генетики, биохимики, микробиологи, ботаники и зоологи, и, конечно же, эволюционисты: практически вся современная систематика основана на его результатах. Секвенирование широко применяется в медицине как метод поиска наследственных заболеваний и изучения инфекций. (См., например, «Уточнение „родословной“ членистоногих » и « Ск верный анекдот: негр, китаец и Крейг Вентер... ». - Ред. )

На самом деле хронологически методы изобретались совсем в другом порядке. Например, секвенирование по Сэнгеру было разработано в 1977 году, а ПЦР, как говорилось выше, только в 1983-м.

Существует множество различных методик секвенирования, но все методы можно разделить на две категории: «классические» и нового поколения. Сейчас используется фактически только один «классический» метод - секвенирование по Сэнгеру , или метод терминаторов. По сравнению с новыми методами, у него есть важное преимущество: длина прочтения, то есть количество нуклеотидов в последовательности, которое можно получить за один раз, у него выше - до 1000 нуклеотидов . В то же время у самого «хорошего» в этом плане «нового» метода секвенирования - 454-, или пиросеквенирования - этот параметр не превышает 500 нуклеотидов . Именно длина прочтения ограничивает возможности новых методов: оказывается крайне сложно «собрать» целый геном из фрагментов размером в несколько десятков нуклеотидов. Как минимум, для этого требуются суперкомпьютеры, а некоторые места в геноме разрешить оказывается просто невозможно, если они содержат высокоповторяющиеся последовательности. В таком случае может помочь сравнение полученных фрагментов с уже имеющимся целым геномом, но таким образом невозможно прочесть геном организма впервые (de novo ). (См. также: «Код жизни: прочесть не значит понять ». - Ред. )

Английский биохимик и корифей молекулярной биологии, дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.). - Ред.

Есть метод нового поколения, позволяющий читать несколько тысяч пн, но с большими ошибками (Pacific Biosciences). 454/Roche сегодня могут читать и больше 500 пн; то же самое уже может и молодое «полупроводниковое секвенирование». - Ред.

Оба упомянутых выше метода секвенирования уже достаточно подробно описаны на «биомолекуле» : очень советую ознакомиться. Я же для примера расскажу про другой распространенный быстрый и дешевый метод (в расчете на один прочитанный нуклеотид) - метод, реализованный в секвенаторах Illumina (видео 2). Основной его недостаток - чтение фрагментов очень короткой длины, не больше 100 нуклеотидов, и вытекающая отсюда сложность прочтения геном «с нуля» .

В этом методе можно выделить три стадии: подготовку библиотеки фрагментов (1), создание кластеров (2) и собственно секвенирование (3).

Видео 2. В интернете есть несколько хороших видео, на которых описан процесс секвенирования Illumina , например на официальном сайте компании (вкладка Technology). Правда, они все на английском языке.

Было уже довольно много сказано про методы работы с нуклеиновыми кислотами и их изучения. Пришло время узнать, каким образом можно выяснить, как же клетка работает - в частности, попытаться определить функцию гена и белка, который он кодирует.

In vitro -мутагенез

Для изучения функции белка очень важно научиться вносить в него мутации . Например, имея организм с неработающим ферментом, можно по биохимическим отличиям понять, что делает нормальный белок. Существуют разные способы создать полностью неработающий ген (как произвольный из всего генома, так и совершенно конкретный - тогда это называется нокаутом этого гена). Один из таких способов - вставка какого-то фрагмента ДНК в геном: если эта вставка придется на ген, то он (точнее, скорее всего, белок, который он кодирует) перестанет нормально функционировать.

Однако существуют способы очень точного изменения последовательности гена и, соответственно, белка. Про один из таких методов - сайт-специфичный мутагенез - я и расскажу. Суть его заключается в изменении конкретного (обычно одного) нуклеотида в последовательности. Для его использования сначала необходимо клонировать этот ген в плазмиде. После этого нужно провести как бы ПЦР с одним праймером. Причем этот праймер должен как раз включать в себя последовательность, которую мы хотим изменить - уже в нужном нам виде. Например, на рис. 14 вместо буквы А, которая должна была бы стоять напротив Т в родительской цепи, в праймере стоит Ц. После синтеза второй цепи ДНК плазмиды, содержащей праймер, в нее будет внесена мутация - А заменится на Ц. Такие плазмиды вводятся в клетки, в которых при делении две цепи окажутся в разных дочерних клетках. Таким образом, в половине клеток-потомков будет изначальный вариант плазмиды, а в половине - мутантный. Тогда, соответственно, половина клеток будет производить нормальный белок, кодируемый этим геном, а половина - мутантный. В случае, изображенном на рис. 14, в нем вместо одной аминокислоты (аспарагина) будет стоять другая (аланин). По аналогии можно вносить случайные мутации с помощью специальной ДНК-полимеразы, вносящей повышенное число ошибок.

Рисунок 14. Схема проведения сайт-специфичного мутагенеза. C. elegans , - то есть, об отключении гена во всех (почти) клетках этого червя.

Такой поразительный эффект достигается с помощью введения в клетку двуцепочечных молекул РНК (дцРНК), одна из цепей в каждой из которых комплементарна участку мРНК «выключаемого» гена. Это открывает поразительные возможности для изучения функций генов. Раньше для отключения генов приходилось создавать «нокаутных» животных (что ученые все равно вынуждены делать, например, с мышами - см. «Нобелевскую премию по физиологии и медицине вручили за технологию нокаутирования мышей ». - Ред. ), у которых изучаемый ген в принципе отсутствует в геноме. Однако создание нокаутов достаточно сложно, а обратно включить ген у таких организмов уже невозможно. С помощью РНК-интерференции отключить ген очень легко, - так же, как и включить, перестав водить в организм соответствующие дцРНК .

Существует три основных способа введения дцРНК в организм. Самый очевидный - впрыскивание в животное их раствора. Пользуются также «вымачиванием» нематод в растворе РНК. Однако оказалось, что можно делать все гораздо проще: скармливать нематодам эти молекулы! Причем особенно удобно то, что это так же замечательно работает, если нематод кормить бактериями (E. coli ), синтезирующими эти дцРНК (рис. 15) .

Рисунок 15. Системная РНК-интерференция. Червь C. elegans экспрессирует зеленый флуоресцентный (светящийся) белок в клетках глотки (ph) и мышцах стенки тела (bm). Слева - изначальный внешний вид. Справа - при РНК-интерференции с помощью «подкормки» бактериями ген инактивируется.

В принципе то, что молекулы РНК из кишечника распространяются практически по всем тканям, довольно удивительно. Известно, что за попадание молекул РНК в клетки кишечника отвечает белковый канал sid-1 , . Однако каким образом РНК распространяются по организму червя, достоверно не известно, - скорее всего, с участием белка rsd-8 Интересно, что все известные белки, принимающие участие в системной РНК-интерференции у C. elegans , имеются и у человека, однако такую эффективную систему искусственного подавления активности генов на системном уровне у человека наблюдать не удается. Если бы была возможность использовать системную РНК-интерференцию у человека, это могло бы стать методом борьбы с огромным набором заболеваний, от простуды до рака .

К слову, использование РНК-интерференции именно на культуре клеток человека позволило выявить, что многие гены человека способствуют развитию вируса гриппа: «Молекулярное двурушничество: гены человека работают на вирус гриппа ». - Ред.

Изучение экспрессии генов: ДНК-микрочипы

При изучении функции гена очень важно узнать, когда и в каких тканях организма он работает (экспрессируется), а также вместе с какими другими генами. Если требуется узнать это про небольшое число генов и тканей, то можно это сделать очень просто: выделить РНК из ткани, провести обратную транскрипцию (то есть, синтезировать кДНК - комплементарную ДНК ) и затем, провести количественную ПЦР. В зависимости от того, прошла ли ПЦР, мы узнаем, имеется ли мРНК исследуемого гена в ткани.

Однако если необходимо проделать то же самое для множества тканей и многих генов, то эта методика становится очень долгой и затратной. В таком случае используют ДНК-микрочипы . Это небольшие пластинки, на которые нанесены и прикреплены молекулы ДНК, комплементарные РНК изучаемых генов, причем заранее известно, где на них (пластинках) какая молекула расположена. Одним из способов создания чипа является синтез молекул ДНК прямо на нем с помощью робота.

Чтобы изучать экспрессию генов с помощью чипов, необходимо также синтезировать их кДНК и пометить ее флуоресцентным красителем (не разделяя кДНК разных генов). Такую смесь наносят на микрочип, добиваясь, чтобы кДНК гибридизовалась с молекулами ДНК на чипе. После этого смотрят, где наблюдается флуоресценция и сравнивают это с расположением молекул ДНК на чипе. Если место флуоресценции совпадает с положением молекулы ДНК, то в данной ткани этот ген экспрессирован. Кроме того, пометив кДНК из разных тканей разными красителями, можно изучать экспрессию сразу нескольких (обычно все-таки не больше 2) тканей на одном чипе: по цвету флуоресценции можно определить, в какой из тканей он экспрессирован (если сразу в нескольких - получится смешанный цвет) (рис. 16).

Однако в последнее время все чаще вместо чипов используют массовое секвенирование всей кДНК из ткани (создание так называемых транскриптомов ), что сильно упростилось из-за развития методов секвенирования. Это оказывается дешевле и эффективнее, поскольку знание полных последовательностей всех мРНК дает больше информации, чем просто сам факт их наличия или отсутствия.

Мы рассмотрели основные методы молекулярной биологии. Надеюсь, что вам стало немного понятнее, каким образом делаются молекулярно-биологические исследования, за что дают Нобелевские премии, и как они могут помочь в некоторых прикладных задачах. Но, более всего, я надеюсь, что вы тоже увидели красоту идей, лежащих в их основе, и, возможно, вам захотелось узнать о каких-то из этих методик подробнее.

Литература

1. Нобелевские лауреаты: Дж. Уотсон , Ф. Крик , М. Уилкинс ;Википедия: 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК) . Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology . 71 , 95-100.