Виды микроскопов, основные характеристики и назначение. Микроскопические методы исследования

Хотя бы один раз в год все люди проходят медицинские осмотры. Но мало кто знает, что происходит с их анализами в лаборатории, и какие диагностические мероприятия с ними проводят. А ведь от правильного лабораторного обследования зависит не только здоровье, но иногда даже жизнь. Поэтому методы микроскопического исследования играют немаловажную роль в выявлении и своевременном предупреждении различных вирусных и инфекционных заболеваний.

Микроскопия и ее разновидности

Микроскопия – исследование объектов посредством микроскопа. Предназначена для изучения микроорганизмов, а также иных объектов, которые непостижимы человеческому глазу. Имеет следующую классификацию:

• Стереоскопическая.

Используется для исследования объектов под разными углами, при этом изучая их двумя глазами. Увеличение небольшое – 120-ти кратное. Такой вид микроскопии используют в оперативном лечении маленьких структур организма, которые недосягаемы для человеческого глаза; в изучении мёртвых тканей; в судебной медицине.

• Инфракрасная.

Принцип действия – поглощение непрозрачных объектов, структурами света, длина волн которых достигает 700-1200 нанометров. Чтобы провести инфракрасную микроскопию не нужно производить специальную химическую обработку объекта. Данный метод применяется в зоологии, науках о биологической природе человека. Используется микроскопия в медицине : инфракрасную микроскопию используют в нейрохирургических целях, а также при изучении глаз, их анатомии и физиологии.

• Ультрафиолетовая.

Изучает свойства объекта посредством определения длины волн, которые поглощают ультрафиолетовое излучение, являясь способностью отдельного вещества, клетки, ткани данного объекта. Такой способностью обладают биополимеры, которые хранят генетический код; нуклеиновые кислоты; пропионовые кислоты; альфа-аминокислоты; калиевая соль; продукты азотистого обмена; лекарственные вещества; кристаллические вещества с температурой плавления больше 290 градусов. Благодаря ультрафиолетовой микроскопии определяют место концентрации искомых веществ, а, если объект живой, то можно исследовать его структурные изменения в процессе жизнедеятельности.

• Люминесцентная.

Основной принцип работы – изучение объектов посредством их свойств свечения в ультрафиолетовых лучах или сине-фиолетовой части спектра. Большинство биологических веществ, например, белки, молекулы небелковой природы, низкомолекулярные органические соединения и лекарственные препараты имеют «врожденную» люминесценцию. Иные вещества светятся лишь после добавления конкретных красителей – синтетических соединений природного характера, которые начинают светиться при контакте с ультрафиолетовыми и синими лучами. Такой краситель может попадать в клетку при малейшем контакте, а может распределяться по клеткам избирательно, окрашивая при этом отдельные биосоединения изучаемого объекта. В мероприятиях, посвященных гистохимическим исследованиям, метод люминесцентной микроскопии – это единственный способ обнаружить вирусную концентрацию в клетках, изучить структуру распада продуктов обмена веществ, определить антигены и антитела. Лечение таких болезней, как герпес, гнойное поражение железистых органов, воспаление тканей печени, грипп – не обходится без люминесцентной микроскопии. Также, с ее помощью можно распознать злокачественную опухоль, предупредить сердечно-сосудистые заболевания, исследовать микрофлору слизистой оболочки носа и диагностировать вирусные недуги.

• Интерференционная.

Имеет общую структуру анализа с фазово-контрастной микроскопией, но в отличие от последней, где можно изучать лишь контуры исследуемого объекта, здесь появилась возможность делать микроскопическую экспертизу прозрачных объектов, а также брать количественный анализ. Такой результат появляется вследствие преломления луча света на два пучка: первый проходит через структурные компоненты изучаемого объекта, а второй минует их. В объективе микроскопа кажется, что оба пучка соединяются и налагаются друг на друга. Разница фаз, которая возникает, можно измерить посредством определения массы разнообразных клеточных структур. Если измерять данную разницу последовательно, используя показатели преломления, то можно узнать плотность, ширину и толщину изучаемых объектов и их тканей, содержится ли в них вода или иные компоненты, имеется ли в них белок. Химические и физические свойства мембран, активность ферментов, обмен веществ на клеточном уровне – это лишь малая часть того, что можно узнать благодаря интерференционной микроскопии.

• Фазово-контрастная.
• Рентгеновская.

Применяется для исследования особо малых объектов, которые по своим размерам не больше рентгеновской волны (0,01-1 нм). Подразделяется на следующие подвиды: проекционная, работающая посредством источника излучения и регистрирующего устройства; отражательная – использует специальные монокристаллы, система зеркал, рассеянное на кристалле рентгеновское излучение.

Своё применение рентгеновская микроскопия нашла в изучении генезиса минералов, медицине, а также науке, изучающей химический состав и структуру металлов. Отличительной особенностью данного метода является возможность изучать непрепарированные живые клетки.

Этот рентгеноструктурный анализ может быть лазерным – когда изучаются одиночные молекулы и их связи.

• Поляризационная.

Лучи, которые появляются посредством поляризации двух взаимоперпендикулярных полостей, образуют свет, в котором исследуют различные объекты – это и есть принцип действия поляризационной микроскопии. Между источником излучения и объектом помещают специальные призмы с эффектом двойного лучепреломления, которые отражают электромагнитные и звуковые волны. В сочетании со специальным светофильтром, такая конструкция позволяет изучать анизотропные структуры клеток, микроскопические компоненты тканей, молекулярную организацию структуры объекта. Поляризационная микроскопия используется для исследования клеток и тканей растительных и животных организмов. Также применяется при идентификации возбудителя различных иммунных заболеваний; при изучении жизни клеток, их жизненно важных компонентов, их функций и процесса размножения. Основное назначение данного метода исследования – изучение животных и растительных тканей, минералов, анизотропных микрообъектов.

• Электронная.

Применяется в случае, если объект находится вне пределов видимости оптического микроскопа. Обычно, размер исследуемых образцов, которые изучаются данным методом – 1 микрон и менее. Принцип действия заключается в использовании потока отрицательно заряженных частиц, которые играют роль светового луча. Линзы в таком микроскопе – магнитные. Отдельные участки исследуемых объектов по-разному задерживают отрицательно заряженные частицы, поэтому изображение получается чёрно-белым, где сам объект увеличен в тысячи раз. Сегодня электронная микроскопия используется для изучения строения, функции и развития клетки. Также применяется в сферах исследования морфологии и структуры микроорганизмов, их жизнедеятельности и генетики. Немаловажный вклад данный метод внес в развитие такой науки как вирусология. Если бы не электронная микроскопия, законы жизнедеятельности клеток были бы до сих пор не изучены, а значит многие онкологические заболевания были бы неизлечимы.

Для того, чтобы провести электронную микроскопию, объекты, которые являются изучаемым материалом, подвергаются физической и химической фиксации, после чего их обезвоживают и разделяют на ультратонкие срезы, чтобы было легче их контрастировать и исследовать.

Электронная микроскопия позволяет увеличивать изображение объекта на много сотен тысяч раз. Минусом данного метода я является то, что он предназначен для изучения неактивных, обезвоженных, мёртвых объектов. Научный вклад в медицину этой методики микроскопии – очень велик, но применять ее в диагностических и практических целях – пока невозможно. Световая и электронная микроскопия имеет общий признак – увеличение изображения с последующим описанием форм объекта и сравнением этих форм с функциональными, а также химическими свойствами

• Иммуноэлектронная микроскопия.

Применяется для исследования взаимодействия антигена и антител. Принцип действия: материал, который исследуется смешивают с иммунной сывороткой, инкубируют его; жидкость и твердые частицы разделяются на фракции по плотности; затем происходит осаждение антител и разделенных частиц на объект; после этого, к смешанному клеточному осадку добавляют вещество, усиливающее контрастность; и только после всего этого, полученный препарат исследуют под микроскопом.

Применяется для диагностики вирусного гепатита, а также для выявления антигенов, которые будут бороться с различными вирусными заболеваниями.

• Световая.

Обеспечивает цветное изображение, увеличенное в две-три тысячи раз. Также, при световой микроскопии возможно продолжительное наблюдение за подвижным объектом, и что немаловажно – микрокиносъёмка. Используется для оценки хода развития объекта, его состояния движения, а также для исследования его изменений под воздействием окружающих его факторов. Кроме разрешающей способности микроскопа, важную роль играет амплитуда светового луча и типология исследуемого объекта, так как свойства последнего имеют огромное влияние на оптическое излучение: цвет, контрастность, резкость, световая фаза, плоскость, по которой распространяется волна. Именно благодаря этим факторам и строится методология микроскопических исследований, например, в данном виде микроскопии, объект окрашивают, чтобы определить его свойства, потому что краска помогает изучить конкретные свойства убитых клеток. Но это не значит, что световая микроскопия занимается изучением лишь мертвых биологических объектов. Благодаря темнопольной микроскопии (подвид оптической), где свойства и чёткость изображения зависит ли излучения, которое рассеивается исследуемым образцом, освещающий световой пучок не попадает в глазок, и картинку изучаемого образца учёные видят в рассеянном свете. Используется для изучения водных одноклеточных организмов, а также живых объектов, которые могут быть как окрашенными, так и наоборот.`]]

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы - это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности.
Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед") имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие, Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого
(микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы

1. Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое; объективом;
7"". Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре;
8. Объектив;
9. выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.

Основную роль в получении изображения играет объектив . Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа , т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения - минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,- зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура-это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

где R - предел разрешения; - длина волны; NA - числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). «Сухой» объектив - это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии-кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
**Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии-обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Настройка освещения н фокусировка микроскопа

Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки света по Келеру , который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3)помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата;
9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора;
11)при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом

При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы - это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная , темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют

Микроскопические методы исследования - способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основусоставляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других микроскопических методов исследования определяющее значение помимо разрешающей способности микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные микроскопические методы исследования . Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1 ). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2 ). Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования , способом микробиологической диагностики , находит применение в цитологических исследованиях и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей - флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования ). С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3 ). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как герпес, эпидемический паротит, вирусный гепатит, грипп и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400-250 нм ). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750-1200 нм . Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид микроскопических методов исследования наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии , в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4 ), при сканирующей - объемное (рис. 5 ). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования , позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30-50 нм . Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. См. также

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе

Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Темнопольная микроскопия

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.

Электронная микроскопия

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

в микробиологии: устройство микроскопа и основные приемы микроскопирования живых микроорганизмов

1 Особенности разных видов микроскопии

2 Устройство светлопольного микроскопа

3 Правила работы с иммерсионным объективом

4 Приемы микроскопирования живых микроорганизмов

1 Особенности разных видов микроскопии

Основными задачами микроскопии являются следующие:

Выявление микроорганизмов в различных материалах.

Ориентировочная идентификация микроорганизмов в образце.

Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).

Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.

На сегодняшний день наиболее используемой является световая микроскопия.

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст).

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм. Контраст изображения – это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, изменяющие световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света – цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 40 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1 000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2 000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы. Числовая апертура – это оптический «охват» линзы, она является мерой количества света, попадающего в линзу. Числовая апертура объектива указана на его оправе. Апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом (т.е. «сухой системы»), не может превысить 1, так как показатель преломления воздуха равен 1. Числовую апертуру можно повысить, если увеличить показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом, приблизив его к показателю преломления стекла (1,5). Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (n = 1,3), глицерина (n = 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла (n = 1,5). Для каждой из указанных выше жидкостей выпускаются специальные объективы, которые называются иммерсионными.

Световая микроскопия включает обычную просвечивающую микроскопию (светло-, темнопольную), фазово-контрастную, люминесцентную. В последнее время разработаны и другие способы микроскопии и микроскопы – инверсионная и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. У светового микроскопа максимальная разрешающая способность составляет 0,2 мкм, что обеспечивает высокоточное увеличение микроскопа до 1500х.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет более четко наблюдать живые прозрачные объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. Действие фазово-контрастного микроскопа основано на интерференции света в плоскости изображения, обусловленной сдвигом по фазе (при использовании фазового кольца в апертурной диафрагме). При фазово-контрастной микроскопии часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики – инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор – сверху.

С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света. При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора. Темнопольная микроскопия является очень простым, но эффективным методом и хорошо подходит для получения изображения живых и неокрашенных биологических образцов. Учитывая простоту установки, качество получаемых изображений весьма хорошее.

При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться при их освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. При использовании ультрафиолетового света разрешающая способность микроскопа может достигать 0,1 мкм.

Клетки микроорганизмов обрабатывают специальными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500–1:100 000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку. В зависимости от химического состава, клеточные структуры в разной степени адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и мертвыми клетками. Это позволяет использовать данный вид микроскопии для цитологических и иммунологических исследований, определения жизнеспособности клеток и т. д.

Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании световых или ультрафиолетовых лучей. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное разрешение современных электронных микроскопов приближается к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.

Короткая длина волны электронов позволяет различить объекты размером 0,5–1,0 нм. В современных электронных микроскопах на экране достигается увеличение 5000– 200 000. Благодаря столь высокому разрешению становится возможным выявление деталей бактериальных структур. Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования .

Электронный микроскоп, в котором изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют просвечивающим (или трансмиссионным ).

В сканирующем электронном микроскопе (растровая электронная микроскопия (РЭМ) пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране. Для РЭМ характерны высокая разрешающая способность, большой диапазон увеличений (до 100 000 и выше), большая глубина фокусировки (~100 мкм), многообразие режимов работы. Сканирующий микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать трехмерное изображение.

Лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить отчетливое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. Данный метод пригоден лишь для исследования самосветящихся (флуоресцентных) объектов. При сочетании с компъютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта. В конфокальном лазерном сканирующем микроскопе изображения внутренних сечений формируются за счет сканирования сфокусированным лазерным пучком от разных (405, 488, 532, 635 нм) лазеров и пространственной фильтрации излучения. При использовании сканирующей микроскопии ближнего поля (СМБП) достигается высокая разрешающая способность. Наименьший размер элемента, полученного с помощью СМБП, составляет 20 нм при длине волны света 0,486 нм. В изображении контролируемого элемента отсутствуют дифракционные или интерференционные эффекты, затрудняющие определение его границ. Отличительной особенностью СМБП по сравнению с атомно-силовым микроскопом является чувствительность к оптическим характеристикам поверхности контролируемого образца, длине волны света, люминесценции и др.

Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур; во многих случаях применяется для изучения живых клеток. Принцип действия автоматизированного интерференционного микроскопа основан на интерференции световых пучков лазерного излучения, отраженного от опорного зеркала и зеркала, на котором помещен измеряемый фазовый объект. Теоретически предельно достижимая разрешающая способность может составить в среднем 0,2 нм, практически она составляет 0,4 мкм.

Рентгеновская компьютерная томография (РКТ), позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) позволяют наблюдать объекты в обычных условиях.